利用同源重組技術(shù)構(gòu)建Chordin 基因載體及其在成纖維細(xì)胞中表達量的研究

劉開東，榮 恒，賀建寧，張夢瑤，趙 明，柳 楠*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東青島 266000；3.青島市動物疫病預(yù)防控制中心，山東青島 266000）

羊毛是毛囊的衍生物，毛囊是表皮向內(nèi)凹陷，通過相互作用，在各種信號通路的協(xié)作下形成的[1]。近年來隨著人們對羊毛質(zhì)量要求的提高，對毛囊的研究顯得尤為重要[2]。敖漢細(xì)毛羊是我國知名的肉毛兼用羊，具有羊毛細(xì)、柔軟度高、體格大等特點，是理想的研究對象[3]。在模式小鼠中，Puas 等[4]在20 年前對于毛囊的發(fā)生發(fā)育給出一套分類方法，將其分為3 個時期8 個階段；隨著近些年遺傳學(xué)手段及二代測序技術(shù)的發(fā)展，Sexna[5]將原本的分類方法進行改進，劃分為10 個階段。關(guān)于羊毛囊的研究目前主要集中在出生后和成年綿羊身上[6]。Stenn 等[7]在成年綿羊身上對毛囊的周期性生長變化展開研究；柳楠等[8]在分子水平上研究了敖漢細(xì)毛羊羊毛性狀形成的機理；王小佳等[9]在分子水平上探究了羊毛的生長部位。大多數(shù)研究都集中在分子水平上，而在細(xì)胞水平上與毛囊生長發(fā)育相關(guān)的研究甚少。因此，本研究通過對其質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞來進行Chordin基因表達量的分析，為該基因在個體水平上的研究提供基礎(chǔ)。

Chordin基因是骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路中的拮抗劑[10]，Chordin 蛋白與BMP2和BMP6的親和力較強，能夠與TSG、BMP 結(jié)合形成蛋白三聚體[11]，進而阻止BMP2和BMP6與其受體的結(jié)合[12]。許多研究表明，BMP 家族中基因抑制毛囊發(fā)育[13]，Chordin作為此家族的拮抗劑，能夠間接促進毛囊發(fā)育。早期研究表明，BMP 信號通路對毛囊的形態(tài)發(fā)生及周期性發(fā)育有重要的調(diào)控作用，秦波等[14]研究發(fā)現(xiàn)在團頭魴胚胎發(fā)育的各個時期都可檢測到Chordin基因，其對胚胎早期發(fā)育起到了重要的調(diào)控作用。Chordin基因在12 個組織中的腦組織表達量較高，推測其參與了腦組織發(fā)育過程，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有較大影響[15]。由此推斷Chordin基因可以通過與BMP 結(jié)合進而對毛囊發(fā)育過程起調(diào)控作用。

目前，關(guān)于Chordin調(diào)控機制研究主要集中在人類、小鼠、斑馬魚等動物中，在細(xì)毛羊中與毛囊相關(guān)的研究較少。因此，本實驗以敖漢細(xì)毛羊為研究對象，采集40 日齡的胎羊，通過對Chordin基因表達載體的構(gòu)建，利用實時熒光定量PCR 和Western Blot 等技術(shù)分析其轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后表達量的變化，旨在為Chordin基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取40 日齡的健康胎羊（由青島畜牧所奧特種羊場提供）并及時消毒處理。TRIZol（Roche）試劑、蛋白裂解液、EcoRI限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、pcDNA3.1 質(zhì)粒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DMEM（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、胰蛋白酶、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、DPBS（磷酸緩沖鹽溶液）、Lipofectamine 2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SoSo 試劑盒、切膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、培養(yǎng)皿等均購自青島尚賽科貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 從組織中提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在綿羊Chordin基因序列（登錄號為XM-027957560.1）CDS 區(qū)外側(cè)通過Primer 5.0 設(shè)計引物，并在上游引物和下游引物的5' 加入同源臂。完成后的引物序列為：F：5'-TTTAAACTTAAGCTCGGAATTCCC CCAGCTGTCCCGTTCG-3'；R：5'-TGGATCCGAGCTC GGCTAGGAGCCTTCATCTTCTTTCCCAGAC-3'。通過PCR 擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，體系25 μL：DNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL，金牌Mix 22 μL。

1.2.2Chordin基因與pcDNA3.1 質(zhì)粒同源重組對pcDNA3.1 質(zhì)粒進行EcoRI單酶切，酶切體系為：EcoRI1 μL、pcDNA3.1 5 μL、Buffer 5 μL、ddH2O 39 μL，置于37℃金屬浴中2 h。電泳檢測后，通過切膠回收試劑盒純化Chordin基因及切開的pcDNA3.1，通過T4 DNA連接酶進行連接，10 μL 體系：Chordin基因1 μL、pcDNA3.1 1 μL、SoSo 5 μL、ddH2O 3 μL，置于50 ℃金屬浴10 min。之后轉(zhuǎn)至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取搖菌后的單菌落對其進行陽性率測定，經(jīng)測序、質(zhì)粒提取最終獲得陽性質(zhì)粒[16]。

1.2.3 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 在羊場取40 日齡胎羊，用75% 酒精清洗2 遍，而后轉(zhuǎn)至實驗室，在培養(yǎng)皿中用75% 的酒精再次清洗3 遍，最后用含有雙抗的PBS 反復(fù)清洗3 遍。用剪刀剪掉頭部和四肢，然后將軀干在體視鏡下剪成1.5 mm3左右（米粒大?。?，將其放在培養(yǎng)皿，加胎牛血清，在CO2濃度為0.05、溫度37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，再加培養(yǎng)液。從培養(yǎng)箱拿出24 h 后，用PBS 沖洗干凈，更換培養(yǎng)液，定時觀察。細(xì)胞生長到95%左右進行傳代培養(yǎng)[16]。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 原代培養(yǎng)后傳至第二代（P2）。用Lipofectamine 2000 進行瞬時轉(zhuǎn)染，實驗組、對照組分別加20 μL 脂質(zhì)體試劑和480 μL DMEM（不含雙抗），混勻，靜置10 min，在實驗組中加入40 μL 構(gòu)建好的表達載體和460 μL DMEM（不含雙抗），對照組僅加入500 μL DMEM，靜置20 min，然后將實驗組和對照組都移到培養(yǎng)皿中均加入4 mL DMEM，在37℃的溫度條件下，培養(yǎng)6 h 后換液，之后培養(yǎng)36 h[16]。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的RT-PCR 擴大培養(yǎng)轉(zhuǎn)染成功的單細(xì)胞，細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部長到95%時，每個板加TRIZol（Roche）試劑3 mL，細(xì)胞裂解后進行RNA 提取。提取完成后，測定濃度和純度符合標(biāo)準(zhǔn)后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA[17]。通過Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計Chordin和GAPDH基因的引物序列，完成后其引物序列見表1。

通過實時熒光定量PCR 反應(yīng)測定表達量，實驗組和對照組各3 次重復(fù)，Chordin相對于內(nèi)參基因GAPDH的表達量用Ct（2-ΔΔCt）值法計算。利用SPSS 17.0 中t檢驗進行數(shù)據(jù)分析[17]。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Western Blot 將樣品分為實驗組和對照組，每組3 個生物學(xué)重復(fù)。先裂解提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，內(nèi)參基因GAPDH、目的基因Chordin分別點3個膠孔，電泳后對蛋白質(zhì)進行PVDF 轉(zhuǎn)膜，用轉(zhuǎn)膜電泳槽進行2～3 h，之后封閉蛋白質(zhì)2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min；按1:2 000 的比例對一抗進行稀釋，在4℃冰箱用一抗孵育PVDF 膜12 h；用TBST 洗膜3 次，每次5 min。以1:2 000 的比例稀釋二抗，孵育1.5 h，在暗室中曝光。用ImageJ 軟件分析條帶，結(jié)果用SPSS軟件進行分析[17]。

表1 引物信息

2 結(jié)果

2.1Chordin目的基因擴增 圖1 為PCR 擴增后凝膠電泳分析結(jié)果（2%瓊脂糖凝膠），擴增條帶位于2 874 bp 處，與已知大小一致。

圖1 Chordin 基因PCR 擴增結(jié)果

2.2 pcDNA3.1 載體單酶切及純化 圖2 為pcDNA3.1 單酶切結(jié)果，1～2 酶切效果良好，pcDNA3.1 載體5 428 bp，與圖中條帶所吻合，可用于后續(xù)實驗。

圖2 pcDNA3.1 載體單酶切鑒定

2.3 表達載體pcDNA3.1 與目的片段重組及鑒定 如圖3 所示，在2 874 bp 處有單一明亮的條帶，為Chordin基因。菌液測序后用BLAST 比對，結(jié)果如圖4 所示，堿基未發(fā)生突變，可用于后續(xù)實驗。提取重組質(zhì)粒，結(jié)果如圖5 所示，1～2 為pcDNA3.1-Chordin重組質(zhì)粒，重組后質(zhì)粒大小為8 302 bp，與圖中條帶相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 電子倒置顯微鏡下，定時觀察。24 h 后細(xì)胞逐漸貼壁，組織塊的四周逐漸有細(xì)胞游出。傳代培養(yǎng)在細(xì)胞密度約為95%時進行，采用胰蛋白酶消化法，2 000 r/min 離心處理分離成纖維細(xì)胞，之后擴大培養(yǎng)，觀察結(jié)果如圖6 所示。

圖3 菌液PCR 擴增結(jié)果

圖4 測序比對

圖5 重組質(zhì)粒的提取

2.5 實時熒光定量PCR 檢測mRNA 的表達 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，擴增的條帶單一明亮，GAPDH產(chǎn)物大小為125 bp、Chordin產(chǎn)物大小為172 bp（圖7），與已知大小均相同，可繼續(xù)實時熒光定量PCR 實驗。

圖6 成纖維細(xì)胞原代、傳代培養(yǎng)

圖7 內(nèi)參基因GAPDH（A）和目的基因Chordin（B）擴增產(chǎn)物

圖8 Chordin 和GAPDH 熔解曲線（A）和擴增曲線（B）圖

如圖8 所示，Chordin和內(nèi)參基因GAPDH的擴增曲線、熔解曲線清晰且只有一個峰值，結(jié)果表明在實時熒光定量PCR 過程中無二聚體且得到特異性的擴增產(chǎn)物，可用來進行定量分析。Chordin基因經(jīng)過質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后其表達量極顯著高于對照組（圖10）。

2.6 Westren Blot 檢測蛋白的表達 由圖10 可知，轉(zhuǎn)染的實驗組條帶明顯比未轉(zhuǎn)染的對照組粗，其灰度值由Image J 軟件進行分析，結(jié)果用軟件SPSS17.0 分析。由圖11 可知，轉(zhuǎn)染組Chordin基因蛋白的表達顯著高于未轉(zhuǎn)染的對照組，表明質(zhì)粒pcDNA3.1-Chordin能高效表達Chordin基因。

圖9 Chordin 基因mRNA 相對表達量

圖10 Chordin 蛋白表達條帶

圖11 Chordin 蛋白相對表達量

3 討 論

多種研究跡象表明，Chordin可作為BMP 基因家族的拮抗劑存在。Elisa[18]在牛中發(fā)現(xiàn)Chordin可以被BMP1和tolloid調(diào)節(jié)，其中BMP1對Chordin的調(diào)節(jié)具有抑制作用，但不能誘導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生過程。Kane 等[19]研究發(fā)現(xiàn)缺氧缺血性視網(wǎng)膜病變是視網(wǎng)膜新生血管形成的主要原因，低氧可誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜周細(xì)胞中Chordin的表達，BMP6有效地參與了血管生成，Chordin在缺氧條件下可通過調(diào)節(jié)BMP6對內(nèi)皮細(xì)胞的作用而對視網(wǎng)膜周細(xì)胞發(fā)揮作用，從而可以促進新生血管的形成。Fabian 等[20]實驗發(fā)現(xiàn)可通過刺激BMP 通路保護腎臟免受急性或慢性損傷，Chordin特異性拮抗BMP7，BMP7在相鄰的遠(yuǎn)端腎單位中表達，Chordin在人的缺血敏感S3 節(jié)段中表達，當(dāng)該節(jié)段退變時，Chordin表達減少，BMP 信號的表達也相應(yīng)減少。結(jié)果表明，Chordin與健康近端小管中的BMP7信號拮抗，降低其表達量，同時導(dǎo)致上皮損傷，損傷的上皮脫落能促進BMP7信號在上皮中再次表達，進而保護腎臟。Mikawa[21]等發(fā)現(xiàn)Chordin在大多數(shù)神經(jīng)元以及它們的樹突和軸突中被強烈表達，在高可塑性灰質(zhì)的神經(jīng)纖維中也觀察到豐富的Chordin表達，例如小腦的分子層和上丘的淺層。Piccolo 等[22]在非洲蟾蜍體中發(fā)現(xiàn)Chordin 蛋白與BMP2和BMP6的親和力較強，進而阻止了BMP2和BMP6與其受體的結(jié)合 。

Petrky 等[12]研究發(fā)現(xiàn)Chordin通過與BMP 結(jié)合而阻斷其與受體結(jié)合，進而阻斷BMP 信號通路。綜上所述，Chordin可與BMP 特異性結(jié)合，干擾BMP 與其受體結(jié)合進而發(fā)揮調(diào)控作用，因此推測Chordin可以通過與BMP 結(jié)合進而對毛囊發(fā)育過程起調(diào)控作用。鑒于此，本實驗通過對pcDNA3.1-Chordin載體的構(gòu)建，通過其表達量的變化，在細(xì)胞層面上檢測Chordin的功能，推斷其與毛囊生長發(fā)育間的關(guān)系。

4 結(jié) 論

本研究通過對pcDNA3.1-Chordin載體的構(gòu)建，通過實時熒光定量PCR、Western Blot 技術(shù)檢測其轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后的表達量，證實Chordin基因過表達，其mRNA 表達量和蛋白的表達量與對照組相比顯著提高。