γ-聚谷氨酸對(duì)小尾寒羊瘤胃發(fā)酵及菌群結(jié)構(gòu)的影響

曹琪娜，張艷梅，敖長(zhǎng)金，張騰龍，張興夫，白 晨，趙亞波，齊景偉

（內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamate，γ-PGA）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過(guò)γ-谷氨酰鍵結(jié)合形成的一種可生物降解的水溶性陰離子聚合物[1]，由傳統(tǒng)發(fā)酵食品（日本納豆等）中的芽孢桿菌類（主要為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）發(fā)酵而成，其分子中富含-COOH、-CO-、-NH-等多種活性基團(tuán)，電荷密度高，具有優(yōu)良的保水性、可食用性、緩釋性和生物相容性等，降解后為小分子氨基酸，不會(huì)帶來(lái)二次污染，是一種新型高分子材料[2]。作為一種可食用、無(wú)毒無(wú)害的生物聚合物，γ-PGA 及其衍生物被廣泛應(yīng)用于食物增稠劑、保濕劑、苦味消除劑、冷凍保護(hù)劑、藥物載體、重金屬吸收劑和動(dòng)物飼料添加劑等物質(zhì)中。研究指出，作為食品補(bǔ)充劑，γ-PGA 在體內(nèi)可以通過(guò)增加鈣的溶解度和腸道吸收來(lái)有效地提高鈣的生物利用度，從而減少人體的骨質(zhì)流失[3]。添加γ-PGA于動(dòng)物飼糧中可促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣等礦物質(zhì)的吸收，有利于降低飼料中礦物質(zhì)的添加量，并能增加蛋殼強(qiáng)度和減少動(dòng)物體內(nèi)脂肪的沉積[4]。Jin 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，口服γ-PGA可有助于將小鼠腸道微生物菌群調(diào)節(jié)為益生菌來(lái)增加小鼠腸道內(nèi)乳酸菌的豐度，同時(shí)減少梭菌數(shù)量，具有穩(wěn)定小鼠腸道微生物和增加腸道微生物組成多樣性的作用。γ-PGA 作為飼料添加劑在反芻動(dòng)物上的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)16S rDNA 高通量測(cè)序分析技術(shù)，探討飼糧中添加γ-PGA 對(duì)小尾寒羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響，為其作為飼料添加劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇與飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)選取檢疫合格、體重為（37.1±0.5）kg 的3 月齡小尾寒羊公羊24只，采用全混合飼糧（TMR），日飼喂2 次（07:00、17:00），自由采食，全天自由飲水。

1.2 試驗(yàn)藥品與儀器設(shè)備γ-聚谷氨酸購(gòu)買自西安瑞盈生物科技有限公司，分子質(zhì)量為20 ku 的冷凍干燥粉，純度為99%。DNA 提取試劑盒（南京建成生物工程研究所）、pH 計(jì)（貝爾分析儀器有限公司，BPH-7200）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIOTEK 公司，Synergy HT 型）、瘤胃液采樣器（上海硅狄科學(xué)儀器有限公司，GCYQ-1-B）及氣相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司，6890N）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與基礎(chǔ)飼糧 采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將小尾寒羊隨機(jī)分成對(duì)照組和試驗(yàn)組，試驗(yàn)預(yù)試期14 d，正試期7 d。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中添加20 g/（只·d）γ-PGA。基礎(chǔ)飼糧參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T816-2004）配制，其中NaHCO3按20 g/（只· d）添加，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

1.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

1.4.1 瘤胃液的采集與處理 在正試期第7 天晨飼2 h后通過(guò)瘤胃液采樣器采集試驗(yàn)羊的瘤胃液，并將采集到的瘤胃液用4 層紗布過(guò)濾（在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行）后先用pH 計(jì)測(cè)定瘤胃液pH，再將濾液等體積充分混勻后轉(zhuǎn)入凍存管后立即投入液氮罐中臨時(shí)保存，再將其轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室后放入-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?duì)照組和試驗(yàn)組每組共有6 個(gè)樣品，將樣品送至上海桑格信息技術(shù)有限公司進(jìn)行分析。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.4.2 測(cè)定指標(biāo) 粗蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（EE）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、鈣（Ca）、磷（P）及代謝能（ME）參照張麗英等[6]的方法測(cè)定，氨態(tài)氮（NH3-N）參照馮宗慈等[7]的方法測(cè)定，微生物蛋白（MCP）和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）均參照周奕毅[8]的方法（氣相色譜儀法）測(cè)定。

1.5 DNA 樣品提取、擴(kuò)增和Miseq 測(cè)序

1.5.1 DNA 的提取 使用DNA 提取試劑盒并按照試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作，提取出樣品中的DNA。

1.5.2 PCR 擴(kuò)增 樣品DNA 擴(kuò)增目的片段為V3+V4 區(qū)，其引物為338F-806R，引物序列為338F：5'-ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3'、806R：5'-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3'。

1.5.3 Miseq 測(cè)序 由上海桑格信息技術(shù)有限公司使用Miseq 2500 PE 250 平臺(tái)上機(jī)測(cè)序樣品Miseq。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用SAS 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)方法分析處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 定義為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1γ-PGA 對(duì)小尾寒羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表2 可知，對(duì)照組與試驗(yàn)組小尾寒羊的瘤胃液pH、丙酸、丁酸、乙酸/丙酸及MCP 間無(wú)顯著差異。試驗(yàn)組小尾寒羊的瘤胃液NH3-N（P＜0.01）、乙酸（P＜0.05）濃度均高于對(duì)照組。

表2 γ-PGA 對(duì)小尾寒羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.2 總DNA 質(zhì)檢結(jié)果 12 個(gè)瘤胃液樣品中總DNA 濃度、純度及質(zhì)量均符合 Illumina Miseq 平臺(tái)測(cè)序要求，可進(jìn)一步用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 16S rDNA 基因v3+v4 區(qū)域擴(kuò)增結(jié)果 由圖1 可知，2 組試驗(yàn)羊瘤胃液樣品中的16S rDNA 基因V3+V4 區(qū)擴(kuò)增條帶大小正確，濃度適宜且條帶單一，可用于后續(xù)測(cè)序試驗(yàn)。

圖1 試驗(yàn)樣品16S rDNA 基因V3+V4 區(qū)域的擴(kuò)增結(jié)果

2.4 操作分類單位（OTU）數(shù)量 通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序結(jié)束后，OTU 劃分樣品的序列，并根據(jù)不同樣品的聚類信息繪制韋恩圖（Venn graph）。試驗(yàn)組樣品獲得97 個(gè)，對(duì)照組樣品獲得86 個(gè)，2 組間共享的OTU為596 個(gè)，飼糧添加γ-PGA 后小尾寒羊瘤胃菌群多樣性升高。

2.5 OTU 稀釋曲線和 OTU Shannon 稀釋曲線 本試驗(yàn)通過(guò)獲取的OTU 數(shù)據(jù)，利用隨機(jī)抽取的序列數(shù)及OUT數(shù)目去建立曲線，得出每組樣品的稀釋曲線，用以表明樣品測(cè)序出的數(shù)據(jù)量能否反映出瘤胃液中的物種多樣性。由圖3、4 可知，當(dāng)測(cè)序深度較小時(shí)，OTU 數(shù)目發(fā)生劇烈變化，并隨著測(cè)序深度的增加而增高。測(cè)序深度達(dá)到15 000reads 數(shù)時(shí)，稀釋曲線趨于穩(wěn)定，說(shuō)明測(cè)序深度已覆蓋到瘤胃液樣品中所有的菌群物種中，測(cè)序結(jié)果可靠。測(cè)序深度達(dá)5 000 reads 時(shí)，Shannon 曲線趨于飽和狀態(tài)，說(shuō)明此測(cè)序量足夠，可以進(jìn)行樣品菌群多樣性分析。

圖2 小尾寒羊瘤胃液菌群韋恩圖

圖3 小尾寒羊瘤胃細(xì)菌OTU 稀釋曲線

圖4 小尾寒羊瘤胃細(xì)菌OTU Shannon 稀釋曲線

2.6 OTU Alpha 多樣性分析 基于OUT 的結(jié)果，計(jì)算出每組樣品的Alpha 多樣性。由表3 可知，試驗(yàn)組Chao-1 指數(shù)高于對(duì)照組，說(shuō)明飼糧添加γ-PGA 使小尾寒羊瘤胃液中菌群豐富度升高，但差異不顯著。試驗(yàn)組的Shannon 指數(shù)高于對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明飼糧添加γ-PGA 能夠提高小尾寒羊瘤胃菌群多樣性。2 組覆蓋率均大于99%，說(shuō)明采集的樣品足以反映瘤胃菌群情況。

表3 樣品Alpha 多樣性指數(shù)

2.7 瘤胃菌群結(jié)構(gòu)分析

2.7.1 門水平 由表4、圖5 可知，小尾寒羊瘤胃液中總共涉及17 個(gè)菌門，主要包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、螺旋菌門（Spirochaetae）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、絲狀桿菌門（Fibrobacteres）及軟壁菌門（Tenericutes）等，其中所含的主要細(xì)菌門即優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門、厚壁菌門及互養(yǎng)菌門，占總細(xì)菌門比例的90% 以上。試驗(yàn)組小尾寒羊瘤胃液中擬桿菌門的相對(duì)豐度高于對(duì)照組，厚壁菌門的相對(duì)豐度低于對(duì)照組，互養(yǎng)菌門的相對(duì)豐度高于對(duì)照組，但差異均不顯著。與對(duì)照組相比，飼糧添加γ-PGA 可降低小尾寒羊瘤胃液中軟壁菌門、螺旋菌門、未注釋細(xì)菌門及藍(lán)藻門的相對(duì)豐度（P＜0.01），增加放線菌門的相對(duì)豐度（P＜0.01）。

表4 γ-PGA 對(duì)小尾寒羊瘤胃菌群門水平上相對(duì)豐度的影響 %

圖5 門水平上瘤胃菌群分布圖

2.7.2 屬水平 在本試驗(yàn)中小尾寒羊瘤胃液菌群總共涉及188 個(gè)屬種。由表5、圖6 可知，相對(duì)豐度較高的29 個(gè)屬種占各樣品中總菌屬的90% 以上，其中所包含的6 個(gè)菌屬的相對(duì)豐度較高，分別是普雷沃氏菌屬（Prevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、奎因氏菌屬（Quinella）、Fretibacterium、Prevotellaceae_UCG-003及解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）。試驗(yàn)組普雷沃式菌屬的相對(duì)豐度高于對(duì)照組，對(duì)照組瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度高于試驗(yàn)組，但差異均不顯著。試驗(yàn)組小尾寒羊瘤胃液中解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）的相對(duì)豐度高于對(duì)照組（P＜0.01）。

2.7.3 組間差異顯著性檢驗(yàn) 由圖7 可知，試驗(yàn)組小尾寒羊瘤胃液中解琥珀酸菌屬的相對(duì)豐度高于對(duì)照組（P＜0.01）。

3 討 論

3.1γ-PGA 對(duì)小尾寒羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 瘤胃pH是反映反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)環(huán)境的重要指標(biāo)之一，其高低可直接影響瘤胃微生物的生長(zhǎng)代謝[9]，并可反映反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的發(fā)酵及其有機(jī)酸的代謝狀況。研究指出，瘤胃液pH 的正常范圍是5.5～7.5，對(duì)其影響最大的主要是飼糧結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)水平[10]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，2 組試驗(yàn)羊瘤胃液的pH 差異不顯著，且均在正常范圍內(nèi)，說(shuō)明飼喂γ-PGA 后小尾寒羊的瘤胃發(fā)酵和代謝均屬正常。瘤胃微生物通過(guò)發(fā)酵飼料中的碳水化合物產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸（VFA），并在此發(fā)酵過(guò)程中釋放出的能量供微生物生長(zhǎng)繁殖利用。VFA 是反芻動(dòng)物主要的能量來(lái)源物之一，其合成受到飼糧結(jié)構(gòu)、品質(zhì)及瘤胃微生物活性等的調(diào)控，其中乙酸、丙酸和丁酸占總VFA 的95%以上[11]。本試驗(yàn)中，2 組飼糧經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵后的主要產(chǎn)物為乙酸，并且試驗(yàn)組小尾寒羊瘤胃中的乙酸含量顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明飼糧中添加γ-PGA 能夠提高粗纖維的降解率，其可能是通過(guò)提高纖維分解菌（解琥珀酸菌屬）的豐度所致。γ-PGA 分子鏈中含有大量的羧基[12]，可能也是引起試驗(yàn)組乙酸升高的原因，有待進(jìn)一步研究分析。2 組試驗(yàn)羊瘤胃丙酸和丁酸含量沒(méi)有顯著差異。研究指出，乙酸/丙酸越高，奶牛的氫濃度和產(chǎn)甲烷菌數(shù)越高，其擬桿菌門和厚壁菌門的豐度越低[13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組瘤胃乙酸/丙酸低于對(duì)照組，這可能是飼喂γ-PGA 后小尾寒羊擬桿菌門和互養(yǎng)菌門的相對(duì)豐度有所提高的原因。

表5 γ-PGA 對(duì)小尾寒羊瘤胃菌群屬水平上相對(duì)豐度的影響

圖6 屬水平上瘤胃菌群分布圖

反芻動(dòng)物瘤胃中的NH3-N 主要來(lái)源于食糜中蛋白質(zhì)的降解，是大部分微生物生長(zhǎng)繁殖所需的原料，因此可用NH3-N 濃度反映瘤胃內(nèi)微生物的活力[14]。研究表明，NH3-N 濃度在6～30 mg/dL 時(shí)，最適宜微生物的生長(zhǎng)繁殖[15]。反芻動(dòng)物瘤胃微生物經(jīng)過(guò)復(fù)雜的發(fā)酵過(guò)程合成MCP，NH3-N 是瘤胃微生物合成MCP 的原料，過(guò)低及過(guò)高的NH3-N 濃度均不利于MCP 合成。研究指出，日糧添加谷氨酸渣可降低瘤胃NH3-N，提高M(jìn)CP 含量[16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組小尾寒羊瘤胃NH3-N 濃度極顯著高于對(duì)照組，并且濃度在6～30 mg/dL，其可能是由于γ-PGA 特異性地增加了瘤胃內(nèi)蛋白分解菌（如普雷沃式菌屬）的數(shù)量而造成的。試驗(yàn)組MCP 含量略高于對(duì)照組，說(shuō)明飼糧中添加γ-PGA 有利于小尾寒羊瘤胃MCP 合成。

3.2γ-PGA 對(duì)小尾寒羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響 瘤胃是反芻動(dòng)物特有的消化器官，因含有豐富的微生物菌群而具有超強(qiáng)的降解纖維物質(zhì)的能力，能將高纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為動(dòng)物性蛋白。瘤胃微生物主要包括細(xì)菌、真菌和原蟲，在消化飼料的過(guò)程中三者共同協(xié)作完成碳水化合物和蛋白質(zhì)等的分解，并具有調(diào)控反芻動(dòng)物的生產(chǎn)效率及健康狀況等功能[17]，細(xì)菌是瘤胃內(nèi)種類和數(shù)目最多且最為復(fù)雜的微生物。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的細(xì)菌主要分布于擬桿菌門和硬壁菌門中，對(duì)瘤胃內(nèi)容物的發(fā)酵過(guò)程具有重要的作用[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加γ-PGA 可極顯著提高小尾寒羊瘤胃菌群多樣性。曾燕[19]研究指出，擬桿菌門和厚壁菌門是綿羊胃腸道中主要的優(yōu)勢(shì)菌門。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加γ-PGA 后，在小尾寒羊瘤胃液菌群的門水平上，擬桿菌門和互養(yǎng)菌門的相對(duì)豐度分別提高了6.3%和3.6%?；ヰB(yǎng)菌屬中所屬的各類菌種均具有降解氨基酸的能力。研究指出，從羊的反芻食物中分離出的互養(yǎng)菌屬能以精氨酸和組氨酸作為底物，降解飼糧中存在的毒素，幫助宿主動(dòng)物生存[20]。本試驗(yàn)中，飼糧中添加γ-PGA 可極顯著降低小尾寒羊瘤胃液中軟壁菌門、螺旋菌門、未注釋細(xì)菌門及藍(lán)藻門的相對(duì)豐度，極顯著增加放線菌門的相對(duì)豐度；飼糧添加γ-PGA 后，小尾寒羊瘤胃液中普雷沃式菌屬的相對(duì)豐度提高了8.2%。普雷沃式菌屬為厭氧的革蘭氏陰性菌，是瘤胃內(nèi)重要的淀粉降解菌，還可以降解多種代謝產(chǎn)物如蛋白質(zhì)、多糖及小肽等。

反芻動(dòng)物的飼料成分主要以粗飼料為主，瘤胃中的纖維降解菌可以降解粗飼料中的纖維物質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而滿足宿主動(dòng)物的能量需求[21]。產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、黃色瘤胃球菌及白色瘤胃球菌是瘤胃內(nèi)的主要纖維降解菌[22]，其中解琥珀酸菌屬中的產(chǎn)琥珀酸擬桿菌為厭氧型革蘭氏陰性菌，具有降解黃白瘤胃球菌所不能降解的纖維素的能力[23]，并且還具有較強(qiáng)的耐抗生素能力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加γ-PGA 后極顯著提高了小尾寒羊瘤胃液內(nèi)解琥珀酸菌屬的相對(duì)豐度。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，飼糧中添加γ-PGA 可極顯著提高小尾寒羊瘤胃乙酸、NH3-N 及菌群多樣性；γ-PGA可在門水平上極顯著降低小尾寒羊瘤胃液中軟壁菌門、螺旋菌門、未注釋細(xì)菌門及藍(lán)藻門的相對(duì)豐度，極顯著增加放線菌門的相對(duì)豐度，可提高擬桿菌門和互養(yǎng)菌門的相對(duì)豐度；γ-PGA 可在屬水平上極顯著提高小尾寒羊瘤胃內(nèi)解琥珀酸菌屬的相對(duì)豐度，也可提高普雷沃式菌屬的相對(duì)豐度但差異不顯著。綜合分析，γ-PGA 具有優(yōu)化小尾寒羊瘤胃微生態(tài)環(huán)境的作用，能改善瘤胃的發(fā)酵，提高飼料利用率。