不同劑量銀杏葉提取物對血管性認知功能障礙大鼠認知功能和神經遞質水平的影響

劉進，周杰，李王文，陳永平，王敬

隨著人口老齡化的不斷加劇，腦血管病患病人數(shù)日益增多，已成為全球第二大死亡原因，血管性認知功能障礙(vascular cognitive impairment，VCI)的患病人群也在不斷增多[1]。VCI是指由腦血管病或腦血管病危險因素引起的從輕度認知功能障礙到癡呆的一大類綜合征，其中腦血管病包括腦梗死、腦出血、慢性腦缺血或腦白質疏松等[2]。VCI不同于阿爾茨海默病、額顳葉癡呆等一系列神經變性病所引起的認知功能障礙，VCI具有可預防、延緩，甚至逆轉認知損害進程的特點[3]。銀杏葉提取物EGb761對中樞神經系統(tǒng)具有保護作用，EGb761包括24%黃酮、6%內脂和其他微量元素，如花青素和有機酸[4]。EGb761的主要作用：改善認知功能及血液循環(huán)、提高組織代謝功能、對抗缺血不利影響[5]。EGb761通過其清除氧自由基、抗氧化作用，抑制脂質過氧化誘導的膜損傷，從而恢復大腦皮質和海馬中受體的減少，進而改善認知功能[6]?，F(xiàn)觀察不同劑量銀杏葉提取物EGb761對VCI模型大鼠的作用及其機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物及分組：清潔級SD大鼠120只[由重慶藥友制藥有限責任公司提供，許可證號：SYXK(渝)2017-0013]，雌雄各半，體質量220～240 g，按照隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、低劑量組、高劑量組，每組30只。(2)藥物及試劑：銀杏葉提取物EGb761(德國威瑪舒培博士藥廠)；5羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、多巴胺(DA)ELISA 檢測試劑盒均購自美國 R&D公司。(3)儀器: Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，酶標儀(BIO-RAD公司)，紫外/可見分光光度計(Perkin Elmer公司)，可調高速勻漿器FSH-2(常州國華電器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立VCI模型： 2019年3—6月在重慶三峽中心醫(yī)院中心實驗室進行實驗, 采取雙血管結扎(2VO)改良法[7]建立大鼠VCI動物模型。以3.0%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，頸部正中備皮并消毒后切開表層皮膚，切口約2 cm，鈍性分離肌肉及筋膜，充分暴露雙側頸動脈，用手術線在頸總動脈遠心端和近心端分別雙結扎，而假手術組不結扎雙側頸動脈；手術完成后縫合皮膚，并回籠飼養(yǎng)。以假手術組大鼠游到平臺所需時間的95%上限值作為標準，綜合大鼠的一般情況評價模型。

1.2.2 給藥方法：4組大鼠VCI手術造模后第2天開始灌胃給藥，低劑量組給予銀杏葉提取物EGb761生理鹽水混懸液50 mg/kg，高劑量組給予100 mg/kg，假手術組和模型組給予同體積的生理鹽水，4組均每天1次， 連續(xù)給藥60 d。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 Morris水迷宮定向航行實驗：水迷宮是由直徑120 cm的白色圓形水槽和直徑12 cm圓形平臺組成，平臺置于水槽中，向水槽中灌水并漫過平臺2 cm。水迷宮分4個象限，在實驗開始前，從1、2、4象限中隨機選擇一個象限邊緣的1/2處將大鼠頭朝向水池壁放入水中，從大鼠連續(xù)給藥的第56天開始測試5 d，觀察SD大鼠的學習和記憶能力，大鼠在水中自由游泳時間<2 min，若大鼠在2 min內找到圓形平臺并停留5 s，則記錄下所用時間;在2 min內，若大鼠沒有找到平臺，則記錄逃避潛伏期為2 min。計算3個象限的逃避潛伏期的平均值作為當天大鼠的逃避潛伏期。

1.3.2 Morris水迷宮空間探索實驗:水迷宮定向航行實驗結束后開始空間探索實驗，撤去位于第3象限的平臺，做好標記后，同時隱蔽第3象限的原有逃生平臺位置，大鼠入水點為第1象限1/2處(平臺象限的對角處)，其余步驟與定向航行實驗一致。記錄2 min內各組大鼠穿過平臺所在位置的次數(shù)、平臺停留時間、有效區(qū)停留時間等。

1.3.3 大鼠腦神經標志物檢測： 干預第15、30、60天水迷宮測試結束后，各組隨取大鼠10只立即斷頭處死取腦，除去腦膜和小腦組織，保留大腦部分；用4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，勻漿，加適量水制成10%腦組織勻漿，于-4℃低溫離心取適量上清液，使用ELISA試劑盒檢測AchE、DA、NE、5-HT水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮定向航行實驗逃避潛伏期比較 整體比較(兩因素重復測量方差分析)：各指標組間差異、時間差異及交互作用均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩精細比較并結合主要數(shù)據(jù)分析：模型組第56～58天的逃避潛伏期長于假手術組，但高劑量組逃避潛伏期短于模型組、低劑量組(P<0.05)，模型組、低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第60天假手術組逃避潛伏期短于模型組，且高劑量組<低劑量組<模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較

2.2 各組大鼠Morris水迷宮空間探索實驗行為的變化比較 整體比較(單因素方差分析)：60天各指標組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與假手術組比較，模型組大鼠平臺停留時間、有效區(qū)停留時間、穿過平臺所在位置次數(shù)均縮短(P<0.05)，與模型組比較，高劑量組各指標均增大(P<0.05)，而低劑量組無明顯變化(P>0.05)；與低劑量組比較，高劑量組各指標均升高 (P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮空間探索實驗行為變化比較

2.3 各組大鼠腦組織中AchE、DA、NE、5-HT水平比較 整體比較(兩因素重復測量方差分析)：各指標組間差異、時間差異及交互作用均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩精細比較并結合主要數(shù)據(jù)分析：第60天，模型組AchE水平高于假手術組，DA、NE、5-HT水平低于假手術組(P<0.05)；低劑量組DA水平高于模型組，高劑量組AchE水平低于模型組，DA、NE、5-HT水平高于模型組，且高劑量組AchE水平低于低劑量組(P<0.05)；低劑量組、高劑量組第60天AchE水平均低于第15、30天，DA、NE、5-HT水平均高于第15、30天(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腦組織中AchE、DA、NE、5-HT水平比較

3 討 論

截至2010年，全世界認知功能障礙患病人數(shù)為3 560萬，預計2030年將增加至6 570萬，到2050年將增加至1.154億[8]。認知功能障礙無法完全治愈，且有效預防措施也較少，VCI是目前所有認知功能障礙疾病中唯一可干預甚至逆轉的認知障礙類型[9-10]。銀杏葉提取物EGb761的臨床藥理作用較為復雜，具有改善線粒體功能和能量代謝、促進海馬神經元分化、提高神經元可塑性、降低血液黏度、增強腦血流量等特點[11-12]。銀杏葉提取物EGb761含有內脂和黃酮，相關研究表明，黃酮類物質可以抑制認知功能障礙等神經變性病的病理學改變，甚至逆轉這一病理學改變[13]。因此，銀杏葉提取物EGb761的藥理效果能夠使其成為改善認知功能的藥物之一，根據(jù)一項銀杏葉提取物EGb761的Meta分析表明，它能夠延緩非癡呆患者認知功能減退的速度，并改善癡呆患者的認知功能[14]。

有研究表明，銀杏葉提取物EGb761有助于改善認知功能障礙患者的認知功能及臨床總體評估[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，VCI大鼠經過60天銀杏葉提取物EGb761干預后，高劑量組的逃避潛伏期、平臺停留時間、有效區(qū)停留時間、穿過平臺所在位置次數(shù)與假手術組比較無差異，表明高劑量銀杏葉提取物EGb761(100 mg/kg)對認知功能有明顯的改善作用，能夠使VCI大鼠的記憶能力逐漸恢復正常水平。而低劑量組的逃避潛伏期短于模型組，且有效區(qū)停留時間、穿過平臺所在位置次數(shù)均多于模型組，但仍與假手術組有差異，表明低劑量銀杏葉提取物EGb761(50 mg/kg)能夠一定程度上改善大鼠的認知功能，但并不能使大鼠的認知功能達到完全正常水平，這提示增加銀杏葉提取物EGb761的劑量可增強其對VCI的認知改善作用，這與既往研究中發(fā)現(xiàn)高劑量銀杏葉提取物可更好地改善血管性癡呆大鼠的認知功能相符，但本研究逃避潛伏期更長，穿越平臺次數(shù)明顯更少，推測可能是與該研究在建模前即注射銀杏葉提取物有關[16]。

認知功能障礙病變的病理基礎與神經遞質水平的改變密切關系，與VCI關系較為密切的神經遞質包括乙酰膽堿、單胺類、氨基酸類及神經肽類等，這些神經遞質對多個認知域起重要作用[17-18]。膽堿能神經遞質系統(tǒng)的破壞是導致中樞神經系統(tǒng)功能障礙和認知功能減退的主要因素，本研究中建模后第15 d模型組、低劑量組、高劑量組的DA、NE、5-HT水平均低于假手術組，AchE水平高于假手術組，這與既往研究的結果相吻合，即在VCI進展期神經遞質水平降低，且大腦皮質、海馬等處的神經活動減少，神經遞質DA、NE、5-HT水平降低，而發(fā)生VCI后，乙酰膽堿的大量水解需要分泌更多的AchE，繼而導致AchE水平升高[19-21]。在VCI的發(fā)病機制中，這些神經遞質發(fā)揮關鍵性作用，并且各種神經遞質之間相互關系較為密切，其中乙酰膽堿與學習、記憶等多種認知功能相關，而AchE大量分泌則意味著乙酰膽堿大量分解，進而造成膽堿神經元損傷，膽堿能神經元的損傷是認知功能障礙相關疾病的關鍵病理改變，因此AchE的升高提示認知功能障礙的發(fā)生[22]。DA遞質在中樞神經系統(tǒng)的尾狀核、殼核、黑質、蒼白球等處含量最高，其參與的黑質—紋狀體系統(tǒng)、中腦邊緣系統(tǒng)是所有運動活動和精神認知活動的基礎[23]。NE遞質主要由交感節(jié)后神經元及腦內的腎上腺素能神經末梢合成、分泌，研究發(fā)現(xiàn)NE在執(zhí)行功能中具有重要的作用[24]。5-HT遞質對大腦皮質中突觸形成和維持有重要促進作用，影響學習記憶、睡眠覺醒、體溫調節(jié)、攝食等多種活動，在與額葉有關的認知功能中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量銀杏葉提取物EGb761(100 mg/kg)能夠降低VCI大鼠腦組織中AchE活性，從而增強信號傳遞，改善大腦記憶力，提高VCI的認知功能。并且發(fā)現(xiàn)高劑量銀杏葉提取物EGb761(100 mg/kg)能同時增加腦組織中DA、NE、5-HT等神經遞質的水平，且隨著干預時間的延長，腦組織中AchE水平逐漸降低，DA、NE、5-HT水平逐漸升高。這一研究發(fā)現(xiàn)表明，高劑量銀杏葉提取物EGb761能夠隨著干預時間的延長，逐漸增加DA、NE、5-HT等多種神經遞質水平，降低AchE水平，進而改善VCI的認知功能。

綜上所述，銀杏葉提取物EGb761能夠改善VCI大鼠的認知功能，提高記憶能力，發(fā)揮延緩和逆轉VCI的作用，且100 mg/kg銀杏葉提取物EGb761作用效果優(yōu)于50 mg/kg，其作用機制可能是通過影響多種神經遞質的表達而實現(xiàn)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉進：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫周杰、李王文：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;陳永平：進行統(tǒng)計學分析；王敬：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核