miR-125b在病毒性腦炎患兒中的表達水平及其與Th17/Treg平衡及預(yù)后的關(guān)系

朱莉，姜遠安，肖冠華，何志毅，李君軍

病毒性腦炎是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的一種疾病，伴有腦實質(zhì)炎性反應(yīng)，病因復(fù)雜多樣，主要是腦實質(zhì)或腦膜被各種病毒入侵后所引起的一種感染性疾病，通常與機體的免疫功能低下有關(guān)[1-3]。 據(jù)統(tǒng)計，兒童病毒性腦炎的發(fā)病率從3.5/10萬～7.4/10萬上升到了16/10萬[4]。不同病情的病毒性腦炎患兒預(yù)后也不同，嚴重者可能出現(xiàn)不同程度的發(fā)育遲緩、肢體癱瘓甚至死亡[5]。因此，早期識別不良預(yù)后的患兒，可以幫助醫(yī)生采取更有效的治療措施來改善患兒預(yù)后情況，但現(xiàn)在臨床上仍然缺乏預(yù)測不良預(yù)后的敏感生物學(xué)指標。近年研究顯示，微小RNA(microRNA，miR)在調(diào)節(jié)細胞發(fā)育和功能中起關(guān)鍵作用，多種miR可用作疾病預(yù)后的生物標志物[6-7]。據(jù)報道，miR-125b與炎性疾病的發(fā)展及T細胞分化有關(guān)，與機體的免疫功能密切相關(guān)，在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中有一定的診斷價值[8]。miR-125b是否通過T細胞分化影響病毒性腦炎的病理過程尚不清楚，與病毒性腦炎患兒預(yù)后的關(guān)系也未見報道，因此本研究通過測定病毒性腦炎兒童血漿miR-125b水平，分析miR-125b與機體輔助性T細胞17(Th17)/調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)平衡的關(guān)系，并探討影響病毒性腦炎患兒不良預(yù)后的危險因素，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2019年11月湖南省郴州市第一人民醫(yī)院兒童危重癥科收治病毒性腦炎患兒110例為腦炎組，其中男72例，女38例，年齡1～12 (4.25±2.74)歲；住院時間7～38(23.42±13.83)d；臨床癥狀：發(fā)熱92例，頭痛46例，有意識改變56例，存在驚厥持續(xù)狀態(tài)34例，伴有應(yīng)激性高血糖35例；致病病毒：腸道病毒78例，巨細胞病毒16例，EB病毒11例，單純皰疹病毒1型3例，單純皰疹病毒2型2例。選取同期體檢健康兒童100例為健康對照組，男68例，女32例，年齡1～12(4.84±2.82)歲。2組對象的性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，受試者家屬或其監(jiān)護人知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①病毒性腦炎患兒診斷符合國際腦炎聯(lián)合會兒童病毒性腦炎的診斷標準[9]；②相關(guān)實驗室檢查和影像學(xué)檢查資料完整；③年齡<14歲。(2)排除標準：①合并其他細菌感染；②合并免疫系統(tǒng)疾??；③存在肝腎功能異常；④近期使用過糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血漿標本采集：患兒于確診次日清晨/健康兒童于體檢當日空腹采集肘靜脈血6 ml， 并儲存在含有肝素鈉的抗凝劑管中， 2 ml用于流式細胞術(shù)，4 ml于4℃離心，將血漿移至新EP管中，在-80℃超低溫冰箱儲存用于檢測血漿miR-125b水平和炎性因子水平。

1.3.2 實時定量PCR檢測血漿miR-125b水平：使用血漿RNA提取試劑盒(哈爾濱新?；驒z測有限公司)提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州易錦生物技術(shù)有限公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時定量PCR。miR-125b正向引物序列：5'-GATCTGCAGCTCTCCCAGGGGCTGGCTTCAG-3'，反向引物序列：5'-GATCATATGGAGGCAGAAAGGATGGAGAAGT-3'；U6作為內(nèi)參，其正向引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。實時定量PCR反應(yīng)體系總體積為20 μl，反應(yīng)體系包括：SYBR Green染料、正向引物、反向引物、dNTP、Taq酶、ddH2O；反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸，連續(xù)40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，miR-125b的表達水平用2-△△Ct表示。

1.3.3 Th17和Treg細胞檢測：上述血液2 ml使用流式細胞術(shù)檢測Th17和Treg細胞，使用PBS緩沖液將血細胞稀釋至8 ml，加入到人淋巴細胞分離液的界面上， 于4℃時離心獲得血清，使用PBS緩沖液洗滌2次，使用流式細胞儀(艾森生物NovoCyte)檢測Th17和Treg，計算Th17/Treg比值。

1.3.4 血漿炎性因子檢測：使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測白介素17(IL-17)、IL-6、IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)水平，試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，操作嚴格按照說明書進行。

1.3.5 預(yù)后判斷： 隨訪6個月，收集相關(guān)信息，使用兒童格拉斯哥預(yù)后量表(GOS)[10]評估病毒性腦炎患兒預(yù)后。GOS 1級：死亡；GOS 2級：植物狀態(tài)；GOS 3級：日常生活學(xué)習(xí)無法自理，需要照料，嚴重殘疾；GOS 4級：日常生活學(xué)習(xí)可獨立，輕度殘疾；GOS 5級：恢復(fù)良好，日常生活學(xué)習(xí)可自理，正?；顒?。將GOS評級1～3級劃分為預(yù)后差亞組， 4～5級為預(yù)后良好亞組。

2 結(jié) 果

2.1 2組血漿miR-125b、Th17、Treg和Th17/Treg比值比較 腦炎組患兒血漿miR-125b、Th17水平和Th17/Treg比值顯著高于健康對照組，Treg水平顯著低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 2組受試者血漿miR-125b、Th17、

2.2 2組炎性細胞因子比較 腦炎組患兒血漿IL-17和IL-6水平均高于健康對照組，IL-10和TGF-β水平均低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 2組受試者血漿IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平比較

2.3 不同預(yù)后患兒臨床資料比較 110例病毒性腦炎患兒中，預(yù)后良好72例(65.45%)，預(yù)后不良38例(34.55%)。 預(yù)后良好亞組和預(yù)后不良亞組患兒的意識改變、驚厥持續(xù)狀態(tài)、是否有應(yīng)激性高血糖、腦CT異常、腦MR異常、血漿miR-125b、Th17/Treg、IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同預(yù)后患兒的性別、年齡、發(fā)熱和頭痛比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同預(yù)后患兒臨床資料比較 [例

2.4 miR-125b、Th17/Treg、炎性因子與預(yù)后的相關(guān)性 腦炎組患兒血漿miR-125b水平與IL-17、IL-6、Th17/Treg及預(yù)后均呈正相關(guān)(r/P=0.810/0.000、0.689/0.004、0.778/0.000、0.793/0.000)，與IL-10和TGF-β水平均呈負相關(guān)(r/P=-0.797/0.000、-0.748/0.000)；腦炎組患兒血漿Th17/Treg與IL-17、IL-6及預(yù)后均呈正相關(guān)(r/P=0.873/0.000、0.701/0.004、0.878/0.000)，與IL-10和TGF-β水平均呈負相關(guān)(r/P=-0.644/0.018、-0.796/0.000)。

2.5 病毒性腦炎預(yù)后多因素Logistic回歸分析 將上述結(jié)果中有統(tǒng)計學(xué)意義的指標納入多因素Logistic回歸分析，其中因變量為病毒性腦炎患兒預(yù)后(1=不良，0=良好)，自變量為意識改變(1=有，0=無)，驚厥持續(xù)狀態(tài)(1=有，0=無)，腦CT異常(1=有，0=無)，腦MR異常(1=有，0=無)，應(yīng)激性高血糖(1=有，0=無)，血漿miR-125b(實際值)，Th17/Treg比值(實際值)、IL-17(實際值)、IL-6(實際值)、IL-10(實際值)和TGF-β(實際值)。結(jié)果顯示，有意識改變、有驚厥持續(xù)狀態(tài)、腦CT異常、腦MR異常、有應(yīng)激性高血糖、血漿miR-125b水平升高是病毒性腦炎患兒預(yù)后的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 病毒性腦炎患兒預(yù)后多因素分析

3 討 論

兒童病毒性腦炎是兒科的常見病，會引起腦組織水腫、壞死、腦功能損害等病理改變，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐、頭痛、意識改變、抽搐、癲癇發(fā)作和局灶性神經(jīng)功能缺失等癥狀，嚴重影響兒童的生活質(zhì)量和生命健康。當兒童抵抗力降低時，病毒可以侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起腦實質(zhì)炎性反應(yīng)[11]。T細胞是人體重要的免疫細胞，主要分為Treg、Th和細胞毒性T細胞[12]。Th17是新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群，與Treg在功能上相互抑制，二者在體內(nèi)的動態(tài)平衡狀態(tài)在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，Th17/Treg失衡可導(dǎo)致感染性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)生[13-14]。

本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒性腦炎患兒血漿Th17水平和Th17/Treg比值高于健康對照組，Treg水平低于健康對照組，說明病毒性腦炎患兒體內(nèi)出現(xiàn)Th17細胞活化，Treg細胞抑制，從而出現(xiàn)Th17/Treg失衡，這一現(xiàn)象與既往研究中細胞感染病毒后，可以誘導(dǎo)Th17細胞活化，抑制Treg細胞活化的結(jié)論相吻合[15]。本結(jié)果顯示，腦炎組患兒血漿IL-17和IL-6水平顯著高于健康對照組，IL-10和TGF-β水平顯著低于健康對照組，說明病毒性腦炎患兒體內(nèi)出現(xiàn)了明顯的炎性反應(yīng)，這是因為Th17可以產(chǎn)生IL-17和IL-6等細胞因子，參與中性粒細胞的增殖、趨化和激活，導(dǎo)致細胞組織炎性損傷[16]。Treg主要分泌IL-10和TGF-β發(fā)揮免疫抑制作用，TGF-β通過反饋調(diào)節(jié)維持Treg數(shù)量和功能，同時還可以抑制效應(yīng)T細胞的增殖和分化[16]。病毒性腦炎患兒體內(nèi)Th17/Treg失衡，進而導(dǎo)致促炎性細胞因子(IL-17和IL-6)分泌增加，抗炎性細胞因子(IL-10和TGF-β)分泌減少，導(dǎo)致腦組織炎性損傷加重，這些機制可能參與了兒童病毒性腦炎的病理過程。

miR是一種非編碼單鏈RNA，可以與mRNA結(jié)合抑制mRNA的翻譯過程，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達[6-7]，既往研究顯示，miR-125b與炎性疾病的發(fā)展和機體的免疫功能密切相關(guān)[8]，本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦炎組患兒血漿miR-125b水平顯著高于健康對照組，說明miR-125b可能參與了病毒性腦炎的發(fā)生發(fā)展過程。本研究腦炎組患兒血漿miR-125b水平與IL-17、IL-6、Th17/Treg、預(yù)后均呈正相關(guān)，與IL-10和TGF-β水平均呈負相關(guān)，表明miR-125b可能是通過影響Th17/Treg的平衡狀態(tài)，進而引起炎性因子釋放紊亂，介導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生來參與病毒性腦炎的發(fā)生發(fā)展過程和預(yù)后。miR-125b引起Th17/Treg失衡的機制可能與視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3有關(guān)，目前有研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可以影響視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達，而視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt在Th17分泌IL-17過程中起調(diào)節(jié)作用，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是Treg細胞的重要調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)Treg細胞的發(fā)育和功能[17]，因此miR-125b可能通過上述途徑影響病毒性腦炎患兒機體內(nèi)Th17/Treg的平衡，從而影響患兒的預(yù)后。

此外，本結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，影響病毒性腦炎患兒預(yù)后的危險因素主要有意識改變、驚厥持續(xù)狀態(tài)、腦CT異常、腦MR異常、應(yīng)激性高血糖和血漿miR-125b水平升高。印澄瑩等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，意識改變的患者內(nèi)側(cè)前額葉、腦干和胼胝體的損傷較其他部位明顯增高，腦MR也顯示意識障礙患者的執(zhí)行控制網(wǎng)絡(luò)和默認模式網(wǎng)絡(luò)的功能連接強度降低，與預(yù)后GCS評分有關(guān)。腦CT異常和腦MR異常直接或間接說明腦實質(zhì)受損，病毒性腦炎MR表現(xiàn)為病灶廣泛，可累及各個部位，出現(xiàn)彌漫性腦組織腫脹甚至病灶出血，累及范圍越大，預(yù)后越差[19]。驚厥持續(xù)狀態(tài)可以導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元死亡，從而引起腦損傷，驚厥持續(xù)時間和次數(shù)都影響患兒的預(yù)后[20]。應(yīng)激性高血糖通常伴有低鈉血癥和低鈣血癥，加速機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)，導(dǎo)致疾病惡化，此外高血糖可以引發(fā)高滲血癥，易引起意識障礙和抽搐[21]，從而影響患兒的預(yù)后。本結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，血漿miR-125b水平升高也影響患兒的預(yù)后，這可能與miR-125b可引起視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達，進而導(dǎo)致Th17/Treg失衡和炎性反應(yīng)加重有關(guān)。

綜上所述，miR-125b與機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，促進Th17/Treg失衡，參與病毒性腦炎的發(fā)病過程，此外，意識改變、驚厥持續(xù)狀態(tài)、腦CT異常、腦MR異常、應(yīng)激性高血糖和血漿miR-125b水平升高是影響病毒性腦炎患兒預(yù)后的危險因素。但miR-125b如何通過機體的免疫反應(yīng)介導(dǎo)病毒性腦炎的病理過程，還需要進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

朱莉：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;姜遠安、肖冠華：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;何志毅：進行統(tǒng)計學(xué)分析；李君軍：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核