蒼防湯對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎中相關(guān)炎癥介質(zhì)的調(diào)控作用

趙新永，顏國(guó)華，曹世霞

(鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 河南 鄭州 451150)

潰瘍性結(jié)腸炎( Ulcerative Colitis，UC)是一個(gè)慢性非特異性的炎性腸疾病，但是原因還沒(méi)有完全搞清楚。損傷主要發(fā)生在直腸和乙狀結(jié)腸。據(jù)報(bào)道歐洲的發(fā)病率是57.9/10萬(wàn)，而挪威高達(dá)505/10萬(wàn)[1]，中國(guó)的發(fā)病率雖然不高，但最近幾年有顯著增加的趨勢(shì)[2]。UC發(fā)病原因復(fù)雜，牽涉到基因?qū)W、免疫學(xué)、感染和環(huán)境因子。臨床治療UC主要有5-氨基水楊酸和皮質(zhì)類固醇治療，中度到重度采用硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤生物制劑治療[3]，但這些藥物都有一定的副作用。

而中藥以及方劑是中國(guó)傳統(tǒng)的寶庫(kù)，臨床有使用蒼防湯治療UC 的報(bào)道[4,5]。中醫(yī)認(rèn)為，UC 與“痢疾”“滯下”“腸澼”“饗泄”相對(duì)應(yīng)，病位在大腸，涉及脾、肝、腎、肺諸臟，飲食不調(diào)常是主要發(fā)病誘因，濕熱蘊(yùn)腸，氣滯絡(luò)瘀為基本病機(jī)，脾虛失健為主要發(fā)病基礎(chǔ)[6,7]?，F(xiàn)在人們已經(jīng)充分地認(rèn)識(shí)到，腸黏膜炎癥的特征是主要由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成的慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，這種作用伴隨著促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ[8,9]。 此外，這些細(xì)胞從血管到炎癥部位的招募依賴于多步的粘附相互作用級(jí)聯(lián)，這些相互作用是分別由粘附分子和趨化因子介導(dǎo)的，例如MUC[10]。

我們本實(shí)驗(yàn)的目的就是利用DSS誘導(dǎo)的大鼠UC模型，研究蒼防湯治療UC的炎癥介質(zhì)的變化機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

3月齡體重200 g左右的SD雄性大鼠，購(gòu)買于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證書：SCXK(豫)2010-0002。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下喂養(yǎng)(溫度(22±2) ℃，相對(duì)濕度(45±10)%，12 h：12 h光/暗周期) ，自由獲取食物和水。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院倫理委員會(huì)要求倫理許可證：2020-010。

1.2 藥物

蒼術(shù)、防風(fēng)、麻黃、白術(shù)、生姜購(gòu)于河南禹州市中藥材市場(chǎng)。蒼術(shù)180 g、 防風(fēng) 150 g、麻黃60 g、白術(shù)150 g、生姜90 g加入去離子水覆蓋，浸泡30 min后，煎煮2 h。過(guò)濾后收集濾液，濾渣中再加入去離子水煎煮1.5 h后，過(guò)濾并收集濾液，合并濾液進(jìn)行冷凍干燥，收集凍干粉儲(chǔ)存于-80 ℃。柳氮磺吡啶(SASP)購(gòu)自上海信宜制藥公司。

1.3 試劑

葡聚糖硫酸鈉(上海翊圣生物科技有限公司，貨號(hào)60316ES25)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)C0105)；一抗：IL-1一抗 (CST公司，貨號(hào)： 9664)、MUC (CST公司，貨號(hào)3033S)、TNFα (proteintech公司，貨號(hào)50599-2-Ig)、IFN-γ (proteintech公司，貨號(hào)26593-1-AP,)；二步免疫組化試劑盒(中杉金橋，貨號(hào)PV9001)；DAB顯色試劑盒(中杉金橋，貨號(hào)ZLI 9018)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L) (碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)A0208)。

1.4 儀器

生物顯微鏡(Olympus，型號(hào)CX21)；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康，型號(hào)FD-1C-80)；低溫高速離心機(jī)(湘儀公司，型號(hào)H2500R-2)；JSM-6390LV 掃描電鏡 JEOL公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型

3月齡SD大鼠隨機(jī)平均分為5組，分別為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(柳氮磺吡啶，SASP:0.67 g/kg)、低劑量蒼防湯、高劑量蒼防湯，每組20只。大鼠饑餓12 h后(斷食不斷水)，恢復(fù)正常飲食，同時(shí)對(duì)照組大鼠繼續(xù)正常飲水，其余大鼠給予5.0% (w/v) DSS無(wú)菌水溶液作為飲水，連續(xù)5 d建立UC模型。第6天，大鼠體重明顯下降，腹瀉、大便出血明顯。停止DSS飲水，給予大鼠正常自由飲水，低、高劑量組分別灌胃給藥1.0 g/kg和10.0 g/kg的蒼防湯凍干粉溶液，治療14 d后。取各組大鼠結(jié)腸組織，統(tǒng)計(jì)重量以及長(zhǎng)度，顯微鏡觀察結(jié)腸損害情況并保存部分組織于-80 ℃冰箱，其余組織用4%多聚甲醛4 ℃過(guò)夜固定，用于HE染色和免疫組化分析。

2.2 HE染色以及電鏡檢測(cè)

將新鮮結(jié)腸組織置于4%的多聚甲醛過(guò)夜固定，脫水后組織包埋，切片，脫蠟，復(fù)水，蘇木素染色1 min，鹽酸-乙醇分化3 s，氨水返藍(lán)20 s，伊紅染色2 min，梯度脫水，透明，封片。顯微鏡拍照。電鏡標(biāo)本固定后送鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室檢測(cè)。

2.3 免疫組化檢測(cè)

常規(guī)切片，脫蠟，復(fù)水，10 mmol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)緩沖溶液(pH6.0)高壓修復(fù)15 min，3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，5% BSA封閉1 h，一抗4 ℃過(guò)夜孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。脫水、透明、封片。 圖像使用NIH圖像J1.36b成像軟件(NIH，Bethesda，MD，美國(guó))獲得與背景區(qū)分染色最好的閾值光密度。 免疫組織化學(xué)分析，確定總像素強(qiáng)度，數(shù)據(jù)以光密度(OD)表示。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠結(jié)腸重量/長(zhǎng)度的影響

在DSS誘導(dǎo)的大鼠模型中，類似于人類潰瘍性結(jié)腸炎的急性期。潰瘍性結(jié)腸炎會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸重量增加，長(zhǎng)度變短，而結(jié)腸長(zhǎng)度比相對(duì)增加。由表1可以看到模型組結(jié)腸重長(zhǎng)比顯著增長(zhǎng)，說(shuō)明疾病模型復(fù)制成功。而陽(yáng)性組和模型組相比，重長(zhǎng)比顯著減小，說(shuō)明治療之后該癥狀有所改善。在蒼防湯治療組中，低劑量和高劑量組都顯著降低了疾病模型大鼠結(jié)腸的重長(zhǎng)比，而高劑量組的改善更為明顯，這說(shuō)明了經(jīng)過(guò)蒼防湯的治療后，該疾病得到了顯著改善。另外，蒼防湯治療組大鼠體重、外觀和模型組相比都有所改善。

表1 蒼防湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠DAI,重量/長(zhǎng)度比以及結(jié)腸損害的影響

3.2 蒼防湯對(duì)結(jié)腸組織表面損傷的保護(hù)作用

用掃描電子顯微鏡(SEM)評(píng)估了蒼防湯治療是否能恢復(fù)DSS給藥后炎癥結(jié)腸粘膜的形態(tài)特征。對(duì)照大鼠結(jié)腸粘膜掃描電鏡觀察顯示，正常上皮有隱窩和一些顆粒肥大細(xì)胞。規(guī)則的微絨毛地毯使上皮表面光滑(如圖1A)。模型組表現(xiàn)為退化的上皮、嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、變寬的溝槽、腺體隱窩的擴(kuò)張，通過(guò)假裂孔狀的方面和杯狀細(xì)胞的耗竭而失去其規(guī)則的形狀，留下一個(gè)不規(guī)則的火山口區(qū)域(如圖1B)。 相應(yīng)地，經(jīng)過(guò)7 d的治療，高劑量蒼防湯組與模型組相比，結(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，與對(duì)照健康組(非結(jié)腸)相似，蒼防湯治療恢復(fù)了微絨毛地毯，使上皮表面光滑(圖1E)。

3.3 蒼防湯抑制IL-1,TNF-α，IFN以及MUC的表達(dá)

在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，促炎因子表達(dá)增加而抗炎因子表達(dá)降低，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜屏障破壞，炎癥反復(fù)發(fā)作，遷延不愈。其中IL-1、TNFα和IFN-γ等促炎因子在該病中發(fā)揮著核心作用，而MUC作為抗炎因子在疾病中顯著減少。為了探討蒼防湯能否調(diào)控這些蛋白的表達(dá)，我們通過(guò)免疫組化檢測(cè)這幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和模型組相比，在低劑量和高劑量組中，蒼防湯都能夠顯著減少IL-1、TNFα和IFN-γ在模型大鼠中的表達(dá)，而增強(qiáng)MUC的表達(dá)(P<0.05)，這說(shuō)明該方劑可以調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達(dá)。具體結(jié)果參見圖2至圖5，以及表2至表5。

A: 正常組; B: 模型組; C: 陽(yáng)性組; D: 低劑量組; E: 高劑量組圖1 大鼠結(jié)腸組織表面電鏡圖(6700X)

A：正常組；B：模型組；C：陽(yáng)性組；D：低劑量組；D：高劑量組圖2 蒼防湯對(duì)IL-1在大鼠結(jié)腸組織中表達(dá)的影響(100x)

A：正常組；B：模型組；C：陽(yáng)性組；D：低劑量組；E:高劑量組圖3 蒼防湯對(duì)TNF-α在大鼠結(jié)腸組織中表達(dá)的影響(100x)

表2 蒼防湯對(duì)IL-1在大鼠結(jié)腸組織中表達(dá)的影響

表3 蒼防湯對(duì)TNF-α在大鼠結(jié)腸組織中表達(dá)的影響

A：正常組；B：模型組；C：陽(yáng)性組；D：低劑量組；E：高劑量組圖4 蒼防湯對(duì)INF-γ在大鼠結(jié)腸組織中表達(dá)的影響(100x)

A：正常組；B：模型組；C：陽(yáng)性組；D：低劑量組；E：高劑量組圖5 蒼防湯對(duì)MUC2在大鼠結(jié)腸組織中表達(dá)的影響(100x)

表4 蒼防湯對(duì)INF-γ在大鼠結(jié)腸組織中表達(dá)的影響

表5 蒼防湯對(duì)MUC2在大鼠結(jié)腸組織中表達(dá)的影響

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是炎癥性腸病的主要形式，這種疾病影響到世界各地?cái)?shù)百萬(wàn)人，其特點(diǎn)是腸黏膜慢性不受控制的炎癥[11,12]。盡管經(jīng)過(guò)大量的研究，UC的發(fā)病機(jī)制仍然知之甚少；促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6和IL-12)與抗炎細(xì)胞因子(如IL-4、IL-10和IL-11)之間的失衡被認(rèn)為在調(diào)節(jié)腸道炎癥中起著關(guān)鍵作用[13-15]。據(jù)報(bào)道，這些炎癥反應(yīng)始于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的突然浸潤(rùn)，激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生廣泛活性的炎性細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1和IL-6的有效組合[16]。傳統(tǒng)的治療有一定的療效，但目前在尋找著新的治療方案。

目前使用中藥治療該疾病越來(lái)越有吸引力，蒼術(shù)防風(fēng)湯由蒼術(shù)、防風(fēng)、麻黃、白術(shù)、生姜組成，原為治“饗泄”而設(shè)。方中蒼術(shù)具有健脾燥濕，祛風(fēng)濕的功效；防風(fēng)具有祛風(fēng)解表，勝濕，止痛止痙的功效；麻黃具有發(fā)汗散寒，宣肺平喘，利水消腫的功效；白術(shù)具有健脾益氣，利水燥濕的功效；生姜具有發(fā)汗解表，溫中散寒，健脾胃的功效。以上諸藥共湊解散風(fēng)邪，通行滯氣，健脾燥濕之功效。但蒼防湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制還未不清楚。

在潰瘍性結(jié)腸炎中，TNF-α的作用在于刺激腸上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)趨化因子以及協(xié)助中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。在本研究中可以觀察到在蒼防湯治療后，能夠調(diào)節(jié)結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。白細(xì)胞介素-1(IL-1)的主要作用是刺激淋巴細(xì)胞增生，募集粒細(xì)胞和激活 CD4+T 細(xì)胞，增加白細(xì)胞介素 17(IL-17)、白細(xì)胞介素 12(IL-12)、干擾素- γ(IFN-γ)等促炎因子的產(chǎn)生，加重腸道炎癥。而IFN-γ的異常分泌，常常導(dǎo)致自身炎癥和自身免疫性疾病?，F(xiàn)在有大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，這些炎癥因子在潰瘍性結(jié)腸炎中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[17,18]。本研究發(fā)現(xiàn)，蒼防湯可以顯著降低這些促進(jìn)因子的表達(dá)，可以推測(cè)可能正是下調(diào)這些促炎因子在結(jié)腸組織中的表達(dá)，而改善了該疾病的癥狀和病理變化。正常情況下腸道黏膜表面與腸道管腔之間存在一道天然免疫屏障——黏液屏障，該屏障對(duì)腸黏膜起到保護(hù)作用。而構(gòu)成結(jié)腸組織黏液屏障的主要成分主要是凝膠狀黏蛋白(MUC)，MUC 對(duì)炎癥性腸病的發(fā)生、發(fā)展和愈合起重要作用。研究也證實(shí)MUC2 基因表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致腸黏膜屏障損害，引起腸黏膜的通透性增加，在大鼠結(jié)腸炎的發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[19]。而本研究中，我們發(fā)現(xiàn)蒼防湯可以促進(jìn)MUC的表達(dá)，而MUC的表達(dá)改善了結(jié)腸粘膜的屏障作用，這可能也是蒼防湯治療該病的一個(gè)機(jī)制之一。

由以上研究可知，蒼防湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制可能是通過(guò)減少IL-1、TNF-α、IFN-γ等促炎因子以及促進(jìn)抗炎蛋白MUC的表達(dá)，進(jìn)而改善了潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀。