多酶恒溫核酸快速擴增技術(shù)在霍亂弧菌檢測中的應(yīng)用

李盛杰，江海濤

(南京曉莊學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院， 江蘇 南京 211171)

0 引言

霍亂弧菌(Vibriocholera)是一種在蝦、蟹等水生動物中廣泛存在的革蘭陰性菌，具有食源性致病風(fēng)險[1，2].水產(chǎn)品中的霍亂弧菌被攝入人體后往往可引起腸道傳染病，發(fā)病急、傳染性強且病死率高，對人類健康的危害極大[3，4].因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，提高霍亂弧菌快速、高效的檢測手段，對于保障食品質(zhì)量安全，維護人民生命健康，加強公共衛(wèi)生防疫方面具有極其重要的意義.目前，針對霍亂弧菌檢測的方法雖然很多，包括免疫檢測法、生化鑒定法、實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(LAMP)等方法，但這些方法均無法同時解決操作煩瑣耗時長、檢測效率與檢測靈敏度低、檢測目標(biāo)單一等問題[5-7].

多酶恒溫核酸快速擴增技術(shù)(Multi-enzyme Isothermal Rapid Amplification，MIRA)的基本原理是在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點形成D-loop區(qū)域，并開始對DNA雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸，這個過程迅速高效地循環(huán)，從而完成目的片段超快速擴增.MIRA依靠多種功能蛋白在常溫下同時作用，實現(xiàn)核酸的快速擴增，是能夠真正實現(xiàn)便攜式的現(xiàn)場快速核酸檢測技術(shù).整體反應(yīng)時間短，僅為5～20 mins，設(shè)備需求低，反應(yīng)溫度為25～42 ℃，后續(xù)可以開發(fā)為熒光檢測、膠體金試紙等快檢手段.霍亂弧菌外膜蛋白ompW基因是霍亂弧菌菌株鑒定中常用的特異性檢測基因，全長654 bp.因此，本研究針對該基因設(shè)計多組合引物，并對相關(guān)引物在多酶恒溫核酸快速擴增中的特異性和靈敏度進行評價.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍亂弧菌基因組DNA和ompW基因質(zhì)粒(濰坊安普未來生物科技有限公司)、瓊脂糖(Sigma公司)、DNA提取試劑盒(諾唯贊生物科技股份有限公司)、DNA Marker及顯色劑(諾唯贊生物科技股份有限公司)、MIRA擴增試劑盒(濰坊安普未來生物科技有限公司).

1.2 儀器

PCR擴增儀(T100TM，Bio-rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(SH-520，杭州申花科技有限公司)、電泳儀(JY300C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、水平電泳槽(JY-SPCT，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司).

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計

結(jié)合霍亂弧菌ompW基因的保守序列，采用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0對引物進行設(shè)計，委托廣州擎科生物技術(shù)有限公司進行合成，具體序列見表1.

表1 引物信息

1.3.2 擴增方法

按照MIRA擴增試劑盒操作流程，每個干粉反應(yīng)管加入29.4 μL bufferA，然后每個反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物和2 μL下游引物；向反應(yīng)管中依次加入9.1 μL ddH2O和5 μL核酸模板，然后向反應(yīng)管中加入2.5 μL BufferB并充分混合；混勻后，將反應(yīng)液甩至管子底部，立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中37 ℃孵育30 mins；反應(yīng)結(jié)束后，加入50 μL酚/氯仿抽提反應(yīng)溶液，12000 rpm離心5 min，取5～8 μL上清進行瓊脂糖電泳檢測.

1.3.3 特異性評價

利用ompW基因質(zhì)粒作為模板，對6對引物的特異性進行檢測，并評價所設(shè)計引物對的特異性.

1.3.4 靈敏度評價

分別將ompW基因質(zhì)粒和提取的霍亂弧菌基因組DNA作為模板，按10倍稀釋為不同濃度的模板.按照MIRA擴增方法進行引物的靈敏度測試.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引物對ompW基因的特異性評價

按照MIRA擴增方法，用ompW基因質(zhì)粒作為模板，濃度為10 fg/μL，上樣量為5 μL，對6對引物組進行擴增實驗(圖1).實驗結(jié)果表明，第1、2組條帶比較清晰干凈.因此，優(yōu)先選擇ompW-2-F1+ompW-2-R1和ompW-2-F1+ompW-2-R2兩組引物進行后續(xù)實驗.

圖1 不同引物對ompW基因的特異性檢測結(jié)果

2.2 不同引物對ompW基因的靈敏度評價

通過上述實驗結(jié)果，我們選擇ompW-2-F1+ompW-2-R1和ompW-2-F1+ompW-2-R2兩組引物進行靈敏度評價.通過ompW基因質(zhì)粒作為模板，每一組引物均設(shè)置10 fg/μL、1 fg/μL、0.1 fg/μL三個不同的模板濃度，進行擴增實驗(圖2).結(jié)果表明，引物對ompW-2-F1+ompW-2-R2在1fg/μL的模板濃度時，擴增條帶比引物對ompW-2-F1+ompW-2-R1顯著清晰.

圖2 兩組不同引物對ompW質(zhì)粒的靈敏度檢測

為進一步驗證引物對ompW-2-F1+ompW-2-R2對ompW基因的靈敏度，我們利用霍亂弧菌提取的核酸作為模板，10 ng/μL按10倍稀釋為7個不同濃度的模板進行驗證(圖3).結(jié)果表明，該引物對在模板稀釋至100 fg/μL濃度時有清晰明亮的條帶，稀釋至10 fg/μL時有微弱條帶，具有較好的檢測靈敏度.

圖3 引物對霍亂弧菌核酸的擴增靈敏度檢測

3 討論

通過多酶恒溫核酸快速擴增體系，我們對全部6對引物組合進行了初篩，結(jié)果顯示ompW-2-F1+ompW-2-R1和ompW-2-F1+ompW-2-R2這兩對引物的條帶最清晰干凈；選擇以上兩對引物進行質(zhì)粒的濃度梯度實驗篩選，兩對引物均在1 fg/μL濃度時有清晰明顯條帶，其中ompW-2-F1+ompW-2-R2的條帶更為明亮，且在0.1 f g/μL濃度時有微弱條帶；最后我們通過霍亂弧菌核酸進行檢測，模板稀釋在至10 fg/μL濃度時仍有微弱條帶，表現(xiàn)出較好的檢測靈敏度.綜上判斷，我們認(rèn)為ompW-2-F1+ompW-2-R2這對引物具備較好的特異性和靈敏度，不僅可以進行霍亂弧菌的快速檢測，也可利用該對引物進行后續(xù)的膠體金試紙條的開發(fā)實驗.