基于脂肪酸標記法和穩(wěn)定同位素技術的通州灣養(yǎng)殖水域海蜇食性分析

張 健 ，王佚兮，馮慧敏，王陳星，唐 議

（1.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306；2.上海海洋大學大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室/上海海洋大學國家遠洋漁業(yè)工程技術研究中心/農業(yè)農村部大洋漁業(yè)開發(fā)重點實驗室，上海 201306；3.上海海洋大學海洋文化與法律學院，上海 201306）

海蜇 (Rhopilema esculentum) 隸屬于腔腸動物門、缽水母綱、根口水母目、根口水母科、海蜇屬[1]，是近岸營浮游生活的暖水性大型水母，主要由水和蛋白質組成，具有很高的食用價值[2]、醫(yī)藥價值[3]和美容價值[4]。我國海蜇野生資源豐富，是重要的海洋捕撈產品之一，為了滿足國內外市場需求，漁民長期過度捕撈使得其野生資源急劇減少，而海蜇養(yǎng)殖業(yè)成為彌補其自然產量的一種必然手段。海蜇生長速度快、養(yǎng)殖周期短、成本低，能夠帶來很高的商業(yè)利益，因此，海蜇人工養(yǎng)殖技術逐漸成為水產養(yǎng)殖的新興產業(yè)[5]。在海蜇養(yǎng)成階段主要以通過施肥培養(yǎng)的浮游生物作為餌料[6-7]，但隨著海蜇的生長，池塘內的浮游生物越來越難以滿足其對餌料的需求。缺乏適合海蜇生長的人工餌料已成為制約其養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要因素。因此，研究養(yǎng)殖海蜇的食性特征對研制人工餌料有重要意義；此外，在可控水域條件下研究海蜇食性，對今后開展我國近海海蜇資源及種群的生態(tài)研究具有參考價值。

傳統(tǒng)的食性研究方法如胃含物分析法，只能獲得近期攝入的食物信息，無法得知被吸收的食物類型[8-9]。20 世紀70 年代以來，生物化學示蹤技術被廣泛應用于營養(yǎng)生態(tài)學研究。生物對脂肪酸的合成及改造能力具有差異性，特定的脂肪酸只能被特定的生物合成，且脂肪酸在食物網的傳遞過程中具有保守性，因此脂肪酸標記法可以用來指示消費者的食物來源并判定生物間的攝食關系[10]。在生態(tài)系統(tǒng)中，碳、氮同位素可通過食物鏈在生物體內穩(wěn)定富集，通過生物體內的穩(wěn)定同位素比值和與其食物相應同位素比值的對比可以有效地揭示較長時間尺度上消費者的食物來源及組成[11]。目前對人工養(yǎng)殖海蜇的研究大多集中在生態(tài)養(yǎng)殖技術[6,12-13]、生長發(fā)育[14-15]、人工育苗[16-17]等方面，對其食性方面的研究甚少，因此，本研究運用脂肪酸生物標記法和穩(wěn)定同位素技術探究養(yǎng)殖成體海蜇的食性，分析其主要攝食來源，為人工飼料的研制提供參考，并為改善養(yǎng)殖海蜇種質退化的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與前處理

養(yǎng)殖海蜇于2018 年10 月24 日隨機取自江蘇通州灣養(yǎng)殖水域，共取樣32 只，均為成熟海蜇(無人工餌料喂養(yǎng))。海蜇捕獲后，置于過濾海水(用0.45 μm 濾膜過濾的表層海水) 中暫養(yǎng)2 h，排空消化道[18]，測定其傘徑 (mm) 和體質量 (g) 等基礎生物學信息，經超離子水潤洗后用干冰冷藏迅速運回實驗室，?80 ℃保存。將冰凍狀態(tài)的樣本放入冷凍干燥機 (Christ Alpha 1-4) ?54 ℃干燥48 h，用混合磨球儀磨成粉末，裝入干燥離心管保存于干燥箱中以備后續(xù)實驗。

1.2 脂肪酸測定

采用改進的Folch 方法提取海蜇中的脂肪酸[19]。取0.2 g 樣品粉末于50 mL 離心管中，加入15 mL 三氯甲烷-甲醇溶液 (2∶1) 浸泡20 h 以上，離心后取上清液于帶塞試管中，加入10 mL 三氯甲烷-甲醇混合溶液沖洗試管內的殘渣，再次離心取上清液，將兩次離心收集的上清液合并，加入4 mL 0.9%的氯化鈉溶液，靜置約2 h。吸取下層溶液置于圓底燒瓶中使用水浴進行蒸餾，得到粗脂肪樣品[20]。繼續(xù)向圓底燒瓶中加入4 mL 氫氧化鉀-甲醇溶液 (0.5 mol·L?1)，混合后連接水浴回流裝置(100 ℃)，水浴加熱5～10 min，加入4 mL 三氟化硼-甲醇溶液煮沸25～30 min，最后加入4 mL 正己烷回流萃取2 min。待圓底燒瓶中溶液冷卻后加入10～15 mL 氯化鈉飽和溶液，搖晃均勻后將溶液倒入試管中靜置1～2 h 分層。使用注射器吸取一定量的正己烷層 (即上層) 溶液進行測量。用美國Agilent 公司的5977A 氣相色譜質譜聯(lián)用儀[21]進行色譜分析。氣相色譜質譜聯(lián)用儀的條件控制為：色譜柱HP-88；初始溫度125 ℃維持0 min，以8 ℃·min?1的速度升至145 ℃，維持26 min，再以2 ℃·min?1的速度升至220 ℃，維持1 min，最后以1 ℃·min?1的速度升至227 ℃，維持1 min；分流比為10∶1。以37 種脂肪酸混標及內標19 烷酸甲酯標品作為標準[22]，通過比對保留時間對脂肪酸進行定性分析，采用內標法對脂肪酸進行定量分析。脂肪酸含量表示為單個脂肪酸占全部脂肪酸總量的百分比。

1.3 穩(wěn)定同位素測定

稱取2 mg 樣品粉末放入錫箔紙中包被，送入IsoPrime 100 穩(wěn)定同位素分析質譜儀 (IsoPrime Corporation，英國) 和vario ISOTOPE cube 元素分析儀(Elementar Analysensysteme GmbH，德國) 進行測定[23]。樣品的碳穩(wěn)定同位素 (δ13C) 組成和氮穩(wěn)定同位素 (δ15N) 組成表達：

其中X=δ13C 或δ15N，R=13C/12C 或15N/14N 的同位素比值。δ13C 標準為Vienna PDB (相當于最初的PeeDee Belemnite 石灰?guī)r標準)，δ15N 標準為大氣N2。

1.4 數據處理

脂肪酸與穩(wěn)定同位素數據均重復測定3 次，以“平均值±標準差 ()”表示，采用SPSS 18.0軟件進行數據統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 基礎生物學

經測定，樣本海蜇傘徑介于190～430 mm，平均傘徑為 (329±522) mm；體質量介于620～5 500 g，平均體質量為 (2 568±1 096) g。傘徑-體質量關系采用冪函數表示為W=4.016×10?4×L2.6926(R2=0.95,n=32)。

2.2 海蜇脂肪酸組成

本研究共檢測出29 種脂肪酸 (表1)，起始碳鏈長度介于14 碳到24 碳。其中飽和脂肪酸 (Saturated fatty acid,SFA) 有10 種，總含量為 (232.05±13.23) %，主要為十六酸 (C16:0) 和十八酸 (C18:0)；單不飽和脂肪酸 (Monounsaturated fatty acids,MUFA) 共有8 種，總含量為 (42.33±4.49) %，主要為十八碳一烯酸 (C18:1 n-9c) 和二十四碳烯酸(C24:1 n-9)；多不飽和脂肪酸 (Polyunsaturated fatty acids,PUFA) 共有11 種，總含量為 (253.31±16.16) %，主要為二十碳五烯酸 (C20:5 n-3,Eicosapentanoic Acid,EPA)、二十二碳六烯酸 (C22:6 n-3,Docosahexaenoic,DHA) 和花生四烯酸 (C20:4 n-6)。n-3 系列脂肪酸含量明顯高于n-6 系列脂肪酸含量。ΣPUFA 和ΣSFA 顯著高于ΣMUFA 含量。

表1 海蜇的脂肪酸組成Table 1 Fatty acids compositions of R.esculentum

2.3 脂肪酸含量與傘徑的關系

用Pearson 檢驗養(yǎng)殖海蜇脂肪酸含量與傘徑的相關性，發(fā)現(xiàn)29 種脂肪酸中僅二十一酸 (C21:0)與傘徑顯著相關 (P<0.05,n=32)，脂肪酸含量隨著傘徑的增加呈逐漸下降趨勢。對于具有食性指示標記的脂肪酸比值分析結果顯示，PUFA/SFA 和DHA/EPA 與海蜇傘徑之間均不存在相關性。

2.4 海蜇的碳、氮穩(wěn)定同位素組成

養(yǎng)殖海蜇不同傘徑的碳、氮穩(wěn)定同位素含量見表2，其中δ13C 的分布介于?23.54‰～?20.75‰，跨度為2.79‰，平均值為 (?22.26±0.66)‰；δ15N的分布介于8.39‰～9.85‰，跨度為1.46‰，平均值為 (9.02±0.29)‰；C/N 為3.37～3.94。

3 討論

海蜇生長極快，從碟狀幼體到傘徑400 mm 的成體水母僅需約3 個月[5]。李培軍等[24]對海蜇的生長研究表明，海蜇的生長呈一條S 型曲線，其生長到某一最大值后，曲線開始下降。本研究分析的養(yǎng)殖海蜇隨著傘徑的增長體質量迅速增大，說明此階段的海蜇未到衰老期。對其脂肪酸和穩(wěn)定同位素進行了以下討論。

3.1 脂肪酸組成

鄭斌[25]對不同發(fā)育階段的養(yǎng)殖海蜇 (營口市榮發(fā)參蜇有限公司) 脂肪酸組成進行了分析，在成蜇(傘徑>15 cm) 中共檢測出28 種脂肪酸，含量較高的幾種脂肪酸分別是C16:0、C18:0、十八碳一烯酸 (C18:1)、花生三烯酸 (C20:3 n-3)、EPA、DHA。本研究海蜇含量較高的脂肪酸分別是C16:0、C18:0、EPA 和DHA，這與鄭斌[25]的研究結果較為接近。劉希光等[26]研究了黃海海域成熟海蜇不同部位 (海蜇皮、海蜇頭、海蜇生殖腺) 脂肪酸的組成，結果發(fā)現(xiàn)3 個部位的脂肪酸組成差別不大，且含量最高的脂肪酸均為DHA、C20:4 n-6、EPA，這與本研究結果稍有差異，推測可能是海蜇成長環(huán)境不同造成，本研究所用的是養(yǎng)殖海蜇，劉希光等[26]采用的是黃海海域自然成熟的海蜇。

3.2 特征脂肪酸分析

特征脂肪酸及其來源參照Alfaro[27]的研究結果。十八碳二烯酸和十八碳三烯酸 (C18:2 n-6+C18:3 n-3) 通常被看作陸地植物的標志[28]，一般含量高于2.5%被認為陸地植物貢獻顯著，本研究海蜇的C18:2 n-6+C18:3 n-3 含量為6.62%，表明陸地植物對其食物來源貢獻較大。EPA 可作為硅藻的特征脂肪酸[29-30]，本研究中養(yǎng)殖海蜇存在大量的EPA，說明硅藻是其重要的食物來源之一。十五酸和十七酸 (C15:0+C17:0) 可用來指示捕食者對浮游細菌的攝食[31-32]。在本研究中，C15:0+C17:0 的含量達到了2.91%，表明碎屑物質是養(yǎng)殖海蜇的食物來源。這一結果與鄭斌[25]研究結果一致。二十碳一烯酸 (C20:1) 和二十二碳一烯酸 (C22:1)可以作為高營養(yǎng)級攝食植食性橈足類的標志脂肪酸[33]。本研究C20:1+C22:1 的含量為5.75%，表明海蜇對植食性橈足類攝食較多[34-45]。C20:4 n-6 被看作底棲生物的標志[36-39]，水母可通過對碎屑[28]及微型浮游動物[40]的攝食在體內累積。海蜇中C20:4 n-6 的含量為6.01%，表明底棲生物對其食物組成貢獻較大。PUFA/SFA 和DHA/EPA 可用來評估營養(yǎng)級的大小，比值越大營養(yǎng)級越高[41]。金鑫等[42]通過DHA/EPA 得出蝶水母 (Ocyropsis crystallina)、瓜水母 (Bero cucumis)、四葉小舌水母(Liriope tetraphylla) 和箭蟲 (Sagittaspp.) 在浮游食物網中的營養(yǎng)級高于中華哲水蚤 (Calanus sinicus)和磷蝦 (Euphausiaspp.)。本研究中PUFA/SFA 和DHA/EPA 與海蜇傘徑之間均不存在相關性，即養(yǎng)殖海蜇成熟后 (>200 mm)，其營養(yǎng)地位沒有發(fā)生明顯的變化。Fukuda 和Naganuma[43]認為Σn-6/Σn-3可用來估算腐生食物鏈與捕食食物鏈對高營養(yǎng)級捕食者的貢獻比例。金鑫等[18]通過比較Σn-6/Σn-3 得出墨綠多管水母 (Aequorea coerulescens) 主要參與腐生食物鏈，本研究Σn-6/Σn-3 較低，說明腐生食物鏈對養(yǎng)殖海蜇攝食貢獻較小。

表2 海蜇碳、氮穩(wěn)定同位素比值和碳、氮含量比值Table 2 Ratio of stable isotope and content of carbon and nitrogen in R.esculentum

3.3 碳氮穩(wěn)定同位素分析

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，δ13C 適于判斷食物來源，而δ15N 用于確定生物體的營養(yǎng)級[44-45]。不同的初級生產者因生長代謝方式不同會導致碳氮穩(wěn)定同位素特征值有很大的差異，因此消費者的碳氮穩(wěn)定同位素值可以反映其食物來源[46]。Boutton[47]認為陸源C3 植物δ13C 介于?30‰～?23‰，δ15N 介于?5‰～18‰；陸源C4 植物δ13C 介于?17‰～?9‰，δ15N 介于3‰～6‰。河口區(qū)浮游植物δ13C 介于?30‰～?19‰，δ15N 介于6‰～9‰[48]。本研究海蜇δ13C 平均值為 (?22.26±0.66) ‰，介于陸源C3 植物和河口區(qū)浮游植物之間且更接近于陸源C3 植物，這可能是因為海蜇對陸源C3 植物碎屑有較多的攝食。金鑫等[18]用δ15N 特征值判斷出蝶水母、瓜水母和四葉小舌水母在浮游食物網中處于較高營養(yǎng)級。本研究中δ15N 值差異不顯著，說明海蜇 (傘徑>200 mm) 食物來源基本趨于穩(wěn)定，這與孫明等[49]的研究結果一致。本研究海蜇δ13C 值、δ15N 值和C/N 與海蜇傘徑的相關性均不顯著 (P>0.05)，說明隨著海蜇個體的成長，其傘徑也逐漸增長，但海蜇在營養(yǎng)位置上并沒有明顯的變化。

4 結語

脂肪酸標記法和穩(wěn)定同位素技術已廣泛應用于海洋生物的食性研究，相比胃含物分析法更能反映出生物較長時間段內的食性[50-51]。碳、氮穩(wěn)定同位素能夠指示有機物的來源，其結果反映的是捕食者在相當長的一個生命階段中所攝取的食物，經過新陳代謝消化吸收的結果。脂肪酸具有生物差異性、保守性和可保存性，可以被特定的生物合成，并通過攝食沿食物鏈向各級消費者傳遞，保留在消費者體內，但值得注意的是，同一種特征脂肪酸可以指示幾個食物來源。因此將脂肪酸與穩(wěn)定同位素相結合，兩者相互補充，可以更準確地反映生物的食性，后續(xù)也應加入胃含物分析研究，3 種方法交叉驗證，使實驗結果更加全面。此外，本研究只對養(yǎng)殖海蜇做了脂肪酸與同位素分析，未采集浮游生物樣本，后續(xù)應對浮游生物樣本進行同等分析，將研究結果與養(yǎng)殖海蜇進行對比，以提高實驗結果的準確性。