吳俊峰,任淑婷
(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,陜西 西安 710000)
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種慢性肉芽腫性病,以肺結(jié)核病最為常見,但亦見于全身各臟器和器官,危害性極大[1],是嚴(yán)重危害人類健康的全球性傳染病之一[2]。近年來,我國結(jié)核病的發(fā)病率持續(xù)上升,其發(fā)病率及死亡率在我國法定傳染病中居首位,是我國重點(diǎn)防治疾病之一[3]。因此,早期準(zhǔn)確診斷是結(jié)核病患者得以及時治療的關(guān)鍵,而提高診斷技術(shù)對早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者至關(guān)重要[4]。目前,醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)核分枝桿菌的方法既有傳統(tǒng)的抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)等技術(shù),又有免疫學(xué)診斷技術(shù)和各種PCR的衍生技術(shù)[5]。本次實(shí)驗(yàn)采用抗酸染色與PCR-熒光探針法同時檢測經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的結(jié)核分枝桿菌,比較兩種方法檢測結(jié)果的一致性,探討兩種方法在結(jié)核病病理診斷中的應(yīng)用價值。
本組資料選自2018年1月至2019年10月西京醫(yī)院疑似結(jié)核患者,共543例,年齡1~90歲,平均(48.29±16.17)歲,其中男性231例,女性312例,檢測標(biāo)本類型包括肺組織、淋巴結(jié)、肝臟組織、腎臟組織、軟組織包塊、大網(wǎng)膜、胰腺、胸腹膜、子宮、關(guān)節(jié)滑膜、椎間盤、胸椎及腰椎、前列腺組織、附睪等,所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,3μm切片,HE染色、抗酸染色及PCR-熒光探針法檢測。
1.2.1 抗酸染色試劑與方法
抗酸染色試劑盒購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司,采用Ziehl-Neelsen法,操作步驟如下:①切片經(jīng)脫蠟后滴加石碳酸復(fù)紅溶液,微火加熱5~10min,重復(fù)滴加并加熱;②冷后水洗,濾紙吸干水分;③滴加酸性酒精溶液脫色1~2min;④水洗后加亞甲基藍(lán)溶液20~30s;⑤水洗,梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。
1.2.2 PCR-熒光探針法試劑與方法
PCR-熒光探針法試劑盒購于湖南圣湘生物科技有限公司,操作步驟如下:①取出試劑盒中的各組分,室溫放置,待其溫度平衡至室溫,混勻后備用;②根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照和陽性參照品A、B、C、D,按比例取相應(yīng)量的反應(yīng)液、酶混合液,充分混勻成PCR混合液,瞬時離心后備用;③在樣本中加入2~3倍體積的4%NaOH溶液,震蕩混勻后靜置液化30min。取液化后的樣本500μL于1.5mL離心管,12000r/min,離心3min,吸除上清;加入1mL無菌生理鹽水重懸沉淀,12000r/min,離心3min,吸除上清;加入50μL核酸釋放劑,100℃處理10min,12000r/min,離心3min,上清作為待測樣本備用;④每個PCR反應(yīng)管中依次加入待測樣本、陰性對照、陽性對照和陽性參照品各5μL;⑤每管加入PCR混合液40μL,蓋上管蓋,2000r/min離心30s;⑥將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽,按對應(yīng)順序設(shè)置陰性對照、陽性對照、陽性參照品及未知樣本,并設(shè)置樣本名稱;⑦選擇熒光檢測通道,50℃UNG酶反應(yīng)2min,94℃Taq酶活化5min,94℃變性15s 45次,57℃退火,延伸及熒光采集30min 45次,25℃儀器冷卻10min。
采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料采用百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析,組內(nèi)比較采用行×列表資料的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)核分枝桿菌為長1.3~3.5μm,寬0.3~0.5μm桿菌,可有彎曲,沒有鞭毛和芽孢,鏡下抗酸菌或呈成群桿菌,或呈小點(diǎn)狀(退變時),菌量少時可見每2~3個細(xì)菌連成“V”、“Y”、“T”等形狀的特有集結(jié),呈鮮紅色,其他細(xì)菌及細(xì)胞呈藍(lán)色(圖1)。
圖1 抗酸染色陽性結(jié)果圖
在543例疑似結(jié)核患者病例中,抗酸染色與PCR-熒光探針法同為陽性者53例,同為陰性者327例,抗酸染色陰性,PCR-熒光探針法陽性者158例,抗酸染色陽性,PCR-熒光探針法陰性者5例,兩種方法符合率為69.98%,抗酸染色陽性檢出率為10.68%,PCR-熒光探針法陽性檢出率為38.86%,差異有顯著性(P<0.001,見表2)。
2.3.1 抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同性別MTB陽性率比較
抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同性別MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001,見表3)且PCR-熒光探針法在不同性別患者的MTB陽性檢出率均高于抗酸染色法。
2.3.2 抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同年齡MTB陽性率比較
抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同年齡MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05,見表4)且PCR-熒光探針法在不同年齡患者的MTB陽性檢出率均高于抗酸染色法。
2.3.3 抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同組織來源MTB陽性率比較
除胸壁、胸膜、腹膜及肝組織外,抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同組織來源MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05,見表5)且PCR-熒光探針法在不同組織來源患者的MTB陽性檢出率均高于抗酸染色法。
見表6、表7。
表1 抗酸染色與PCR-熒光探針法染色結(jié)果
表2 抗酸染色法與PCR-熒光探針法檢測結(jié)果的比較
表3 兩種方法檢測不同性別MTB陽性率比較[n(%)]
表4 兩種方法檢測不同年齡MTB陽性率比較[n(%)]
表5 兩種方法檢測不同組織來源MTB陽性率比較[n(%)]
表6 抗酸染色法的Youden指數(shù)
表7 PCR-熒光探針法的Youden指數(shù)
結(jié)核病病理形態(tài)學(xué)主要表現(xiàn)為壞死性肉芽腫性炎,中央為干酪樣壞死,外圍由類上皮細(xì)胞、朗格漢斯巨細(xì)胞、反應(yīng)性增生纖維母細(xì)胞及淋巴細(xì)胞構(gòu)成[6],但在實(shí)際工作中,結(jié)核病的病理變化既有典型的病變,也常出現(xiàn)不典型的病變,給結(jié)核病的診斷造成困難,因此,找到病灶組織中結(jié)核分枝桿菌成為病理學(xué)診斷的重要依據(jù)[7]。
抗酸染色是檢測結(jié)核分枝桿菌的傳統(tǒng)方法,可用于痰涂片和組織切片染色,其方法簡單、成本低、特異性高,但是靈敏度低,易造成假陰性[8]。PCR法是根據(jù)DNA復(fù)制原理而設(shè)計的體外DNA或RNA擴(kuò)增方法,優(yōu)點(diǎn)是具有高度的敏感性和特異性,且操作較簡單,已成為結(jié)核診斷的最佳檢測方法[9]。本實(shí)驗(yàn)對來自西京醫(yī)院的543例疑似結(jié)核患者同時進(jìn)行抗酸染色和PCR-熒光探針法檢測,比較兩種方法的陽性檢出率及符合率。結(jié)果顯示:抗酸染色法陽性檢出率為10.68%(58/543),PCR-熒光探針法陽性檢出率為38.86%(211/543),兩者符合率為69.98%,其中抗酸染色法陽性而PCR-熒光探針法陰性者有5例,分析其原因可能為:①抗酸染色法不僅使結(jié)核分枝桿菌呈陽性,非結(jié)核分枝桿菌如麻風(fēng)桿菌也會呈陽性;②若樣本含菌量極少,經(jīng)修片、切片后抗酸染色切片內(nèi)含少量菌,PCR組織內(nèi)可能會不含菌??顾崛旧幮远鳳CR-熒光探針法陽性者158例,分析其原因可能為:①結(jié)核分枝桿菌較小,在鏡下觀察有一定的難度,具有觀察者的主觀差異,尤其是活檢小標(biāo)本菌量少的易漏診[10];②若取材組織來自壞死灶中心特別是陳舊性壞死中心,而非肉芽腫內(nèi)或干酪樣壞死灶周圍,常因中心缺氧,不利于細(xì)菌生長,難以查見;③結(jié)核分枝桿菌在較陳舊或經(jīng)過治療的病灶內(nèi)可見短桿、顆粒及彎桿狀的變異形態(tài),易誤診。
本文還比較了不同性別及年齡對抗酸染色和PCR-熒光探針法檢出率的影響,結(jié)果顯示:不同性別及年齡對抗酸染色和PCR-熒光探針法結(jié)果無明顯影響;同時,本文還對來自不同性別、年齡及組織來源的患者標(biāo)本采用兩種方法檢測的陽性檢出率進(jìn)行比較,結(jié)果顯示:在不同性別及年齡的患者標(biāo)本中,PCR-熒光探針法陽性檢出率均顯著高于抗酸染色法;在不同組織來源中,除胸壁、胸膜、腹膜及肝組織外,抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同組織來源MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義且PCR-熒光探針法陽性檢出率均顯著高于抗酸染色法。胸壁、胸膜、腹膜及肝組織等組織來源可能因標(biāo)本例數(shù)太少導(dǎo)致兩種方法的陽性檢出率無統(tǒng)計學(xué)意義。
543例疑似結(jié)核患者中已知明確臨床診斷結(jié)果者共187例,其中陽性105例,陰性82例,PCR-熒光探針法Youden指數(shù)(J=0.5245)顯著高于抗酸染色法Youden指數(shù)(J=0.2095)。
綜上所述,PCR-熒光探針法檢測石蠟包埋組織中的結(jié)核分枝桿菌,陽性檢出率顯著高于抗酸染色法,具備較高的診斷價值,可結(jié)合病理組織學(xué)特點(diǎn)為臨床提供可靠的診斷依據(jù)。