血液濾過聯(lián)合烏司他丁對膿毒癥患者臟器功能及炎性因子的影響

李愛軍 苗進昌 高艷玲 張坤 曹志嬌 秦莉

膿毒癥對人類的健康構成了嚴重威脅。膿毒癥常常繼發(fā)于燒傷、嚴重感染、創(chuàng)傷、術后等情況，也是其主要死亡原因[1,2]。膿毒癥的國際共識認為，膿毒癥是機體在感染后出現(xiàn)的炎性反應(SIRS)與抗炎反應(CARS)失調(diào)而導致的多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，危及患者的生命[3]。這個定義直接反映了膿毒癥的病理生理過程，有利于對膿毒癥的快速識別，提高膿毒癥的臨床診斷率，指導臨床醫(yī)生對它的治療。機體任何部位在感染了病原微生物后，都可能發(fā)展成為膿毒癥。尤其是老年和患有基礎疾病的患者，泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等部位是細菌病毒及非典型病原體的易感部位，所以這些患者的感染常導致全身炎性反應綜合征，進而發(fā)展成為膿毒癥、感染性休克和多臟器衰竭。近年來，大量動物實驗對膿毒癥的病理生理機制進行了深入的研究，臨床診斷方法、治療手段不斷提高，但該病的發(fā)病率和死亡率仍然很高。既往有研究發(fā)現(xiàn)，血液濾過(CVVH)和烏司他丁(Ulinastatin)在清除體內(nèi)毒素和炎性細胞因子方面有顯著作用，同時還能夠改善血管內(nèi)皮細胞的損傷[4]。但該方法聯(lián)合對膿毒癥患者的治療效果尚不清楚。因此本研究采取隨機、對照的方法，選取在我院就診的、符合入選條件的膿毒癥患者240例，使用上述方法進行治療，探討其對膿毒癥患者的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2018年12月、符合入選標準的患者240例。依據(jù)電子計算機隨機數(shù)的方法分為對照組、血濾組、聯(lián)合治療組，每組80例。對照組：男43例，女37例；平均年齡(65.3±6.1)歲；既往史：冠心病19例，腎功能損傷27例，肝功能障礙10例，糖尿病病史24例。血濾組：男41例，女39例；平均年齡(62.1±5.9)歲；既往史：冠心病17例，腎功能損傷25例，肝功能障礙15例，血糖升高符合糖尿病診斷標準23例。聯(lián)合治療組：男38例，女42例；平均年齡(67.0±7.1)歲；既往史：冠心病21例，腎功能損傷27例，肝功能障礙13例，糖尿病患者19例。3組患者年齡、性別比、基礎疾病等差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會論證，符合醫(yī)學倫理學要求?；颊哌M入試驗前向家屬告知研究目的及背景，由于本試驗標本的采集僅為抽血檢查，不會給患者帶來任何傷害。有試驗經(jīng)費做保障，不增加患者額外的經(jīng)濟負擔，同時保護患者隱私，不向外界泄露患者個人身份信息和醫(yī)學信息。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 入選標準：①醫(yī)院治療>36 h；② 80歲>年齡>20歲；③滿足第三版膿毒癥國際共識發(fā)布的診斷標準[5]：體溫>38℃或<36℃，白細胞計數(shù)>12.00×109/L,PaCO2<32 mm Hg或呼吸頻率>20次/min，心率>90次/min；④參照“2018中國膿毒癥休克(septic shock)急診治療指南”的診斷標準[5]：積極補液后，血壓仍不能維持，在應用血管升壓藥物后，平均動脈壓維持在>65 mm Hg，血乳酸(lactic acid)>2 mmol/L，即可診斷為膿毒癥休克；⑤確定感染的患者，3分

1.2.2 排除標準：①1個月內(nèi)使用過激素、免疫抑制劑等藥物的患者；②既往有惡性腫瘤的病史；③機體患有嚴重的免疫系統(tǒng)疾病(如：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、艾滋病等)；④精神異常患者；⑤入院后不足96 h，自動放棄治療和死亡出院的患者；⑥將課題研究的方法及目的明確告之病患和家屬，明確表態(tài)不愿意參加的；⑦診斷、檢查及用藥等資料缺失的病例。

1.3 方法

1.3.1 對照組：按照《拯救膿毒癥指南》和《第三版膿毒癥國際共識》的建議給予基礎治療，盡快液體復蘇，入院后6 h內(nèi)，使中心靜脈壓維持在1.07～1.60 kPa，平均動脈壓>8.67 kPa，尿量>0.5 ml·h-1·kg-1體重，中心靜脈血氧飽合度>70%，同時給予積極抗感染及營養(yǎng)支持等對癥治療[6]。

1.3.2 血濾組：患者采用股靜脈及頸內(nèi)靜脈建立血管通道，留置ARROW中心靜脈導管(雙腔CS-22502-5Fr×5 cm，18～20 Ga，無藍空針)，采用金寶(Grmbro)公司GBS21-LH87A血液凈化系統(tǒng)行CVVH治療，濾器使用帶有負電的膜材，型號為：NA69-ST，總面積1.5 m2，管路型號：TAC-65-KL，血流速控制150～200 ml/min，動脈壓-400～-100 mm Hg，患者從入院到血濾開始的平均時間為(126.18±3.96)h，血濾治療的平均時間(87.26±4.43)h。置換液在濾器前分別采用二路液補充，流速約3 500 ml/h。一路液配方為：注射用水1 500 ml、0.9%氯化鈉2 500 ml、50%葡萄糖30 ml、10%氯化鉀15 ml、10%氯化鈣7 ml、25%硫酸鎂5.0 ml；另一路液為5%碳酸氫鈉120 ml、0.9%氯化鈉溶液380 ml。置換液在配制過程中還要根據(jù)患者內(nèi)環(huán)境的酸堿電解質(zhì)情況進行適當調(diào)整。在CVVH中，患者的脫水量依據(jù)體內(nèi)的液體負荷來確定。根據(jù)凝血指標使用肝素抗凝，肝素鹽水用1 000 ml 0.9%氯化鈉加10 000 U肝素鈉配制。在行CVVH前，為防止管路凝血，首先使用肝素鹽水對機器進行預沖0.5 h。給患者肝素負荷量12 U/kg，然后持續(xù)泵入8 U·kg-1·h-1。每2小時抽血查APTT時間，調(diào)整肝素用量。在入組患者中，因凝血異常8例，進行無肝素的CVVH治療。

1.3.3 聯(lián)合治療組：除進行CVVH治療外，給予烏司他丁50萬U溶于0.9%氯化鈉100 ml靜脈滴注，2次/d，烏司他丁由廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.4 觀察指標

1.4.1 病情嚴重程度評分:患者開始治療前及治療96 h后最差的功能指標，按照美國華盛頓大學醫(yī)學院Knaus教授制定的急性生理與慢性健康(APACHEⅡ)評分以及歐州重癥醫(yī)學會提出的序貫器官功能衰竭評分(SOFA)等級進行量化打分。

1.4.2 肝腎功能檢測:患者入院后，治療前及治療96 h 由上肢靜脈抽血，5 ml放入血常規(guī)管，5 ml放入肝素生化管，低溫條件下，4 500 r/min的速度進行離心0.5 h，取出血清在超低溫(-80℃～-70℃)的冰柜中保存。采用日本東亞公司生產(chǎn)的Sysmex RX-35電阻抗脈沖血細胞分析儀進行白細胞WBC檢測。放射免疫分析法(RIA)測定降鈣素原PCT，檢測采用德國勃拉姆斯公司生產(chǎn)的Bramhms AF-365型試劑盒，廣州華科萬孚科技有限公司生產(chǎn)的ZF431型免疫定量檢測系統(tǒng)。免疫熒光定量法檢測C-反應蛋白(CRP)的含量，將血樣加入檢測緩沖液中，血清中CRP與緩沖液中帶有熒光標記的抗體結合，形成抗原-抗體復合物，復合物中的熒光強度代表了血清中CRP的含量，用微量移液槍將該復合物注入到i-RNQAZH Founder免疫熒光分析儀中進行處理，即可檢測到樣本中CRP的含量。生化指標[包括：丙氨酸轉氨酶(ALT)、門冬氨酸轉氨酶(AST)、部分活化凝血酶原時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、總膽紅素(TB)、間接膽紅素(IB)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)]檢測使用Olympus AP-6500型全自動生化分析儀，試劑由武漢華科生物技術有限公司生產(chǎn)。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿中TNF-α、IL-6、IL-13的含量：患者治療前及治療96 h后外周靜脈采集EDTA抗凝血3 ml，放入低溫(4℃)超高速(8 000～10 000 r/min)離心機中離心20 min，超低溫(-80℃～-70℃)冰箱內(nèi)保存，以備檢驗。使用北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)的TGP065 ELISA試劑盒，嚴格按照說明書要求進行操作。使用德國默賽生產(chǎn)的飛酶標比色儀SH11/GF-M2000測定(OPD 用 492 nm)OD 值。

2 結果

2.1 3組患者臟器功能損傷評分比較 3組患者治療前及治療96 h后APACHEⅡ評分和SOFA評分較治療前均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CVVH治療后，血濾組和聯(lián)合治療組患者的APACHEⅡ和SOFA評分較對照組下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。聯(lián)合治療組患者加用烏司他丁治療后，患者的臟器功能APACHEⅡ和SOFA評分顯著降低，與對照組和血濾組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組患者臟器功能損傷評分比較 n=80,分,

2.2 3組患者炎性指標比較 3組患者治療96 h后，血清中WBC、CRP、PTC的水平均明顯降低，與治療前比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；血濾組患者應用CVVH治療后，與對照組患者比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；應用烏司他丁治療后，聯(lián)合治療組患者的WBC、CRP、PTC較對照組和血濾組均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組患者炎性指標比較

2.3 3組患者血液生化指標比較 治療96 h后，患者血液中ALT、AST、TB、IB、Cr、BUN的含量較治療前均有不同程度的下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；應用CVVH治療后，血濾組肝腎功能指標較對照組明顯好轉，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；聯(lián)合治療組應用烏司他丁后，肝腎功能指標好轉更加顯著，與對照組和血濾組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組患者血液生化指標比較

2.4 3組患者炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-13水平比較 3組患者治療后，血漿中TNF-α、IL-6、IL-13的含量均明顯下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。血濾組患者治療后，與對照組比較，3種炎性細胞因子下降顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。聯(lián)合治療組患者加用烏司他丁后，血漿TNF-α、IL-6、IL-13的水平進一步降低，與對照組和血濾組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組患者炎性細胞因子比較

3 討論

膿毒癥是臨床上常見的急危重癥，也是ICU患者死亡的主要原因之一。膿毒癥的發(fā)病與應激、氧化、凋亡、神經(jīng)免疫、肝臟、腎臟、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)調(diào)控密切相關?；A實驗和臨床研究均證實，膿毒癥是感染誘發(fā)的多系統(tǒng)反應的結果，機體在嚴重感染后，免疫、內(nèi)分泌等系統(tǒng)迅速被調(diào)動，引起炎性因子的瀑布式級連反應，產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，通過自分泌、體液分泌等形式釋放出來，在炎性反應的同時，抗炎物質(zhì)也大量產(chǎn)生，因此出現(xiàn)了宿主對感染的嚴重失衡，這種炎癥和抗炎介質(zhì)的過度釋放對機體產(chǎn)生的損傷要比單純感染嚴重的多[7]。伴隨著對膿毒癥研究的深入，人們越來越關注細胞因子對臟器功能的損傷(MODS)，它們之間的關系也成為當前膿毒癥研究的熱點。已有研究表明，這些炎性因子的產(chǎn)生與體內(nèi)的巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等免疫細胞的活化有直接關系[8]。在關于膿毒癥的前期研究中發(fā)現(xiàn)，臟器中炎性細胞因子的聚集以及在臟器局部的活化、激活、氧化反應和抗氧化反應的失衡是膿毒癥臟器功能衰竭的病理生理學基礎[9]。因此只有阻斷炎性細胞因子產(chǎn)生的途徑，減少器官臟器中炎性因子的含量，才能預防膿毒癥相關的MODS的產(chǎn)生。本試驗中我們具體考查TNF-α、IL-6、IL-13在臟器功能損傷中的作用。

TNF-α是人體抵抗病原微生物的關鍵因素，由單核巨噬細胞、淋巴細胞及內(nèi)皮細胞等免疫細胞產(chǎn)生和釋放，它是炎性反應中產(chǎn)生最早的細胞因子，也是炎癥級聯(lián)反應的啟動因素，在導致器官損傷的病理過程中，它貫穿其中并起重要作用[10]。主要表現(xiàn)在以下方面：(1)在細胞內(nèi)通過電子傳遞產(chǎn)生氧自由基，啟動細胞凋亡程序，活化核酸內(nèi)切酶破壞組織細胞DNA，導致細胞的死亡。(2)能夠誘導如IL-6、IL-13、TGF-β等其他炎性細胞因子的產(chǎn)生、釋放和遷移，炎性因子在器官局部呈現(xiàn)高濃度，加重局部炎癥。(3)TNF-α損傷血管內(nèi)皮細胞，促使中性粒細胞與受損的內(nèi)皮細胞粘附，進一步損傷內(nèi)皮細胞，同時激活血管內(nèi)凝血，抑制纖溶系統(tǒng)，形成血管內(nèi)微血栓，破壞組織器官的血液循環(huán)。IL-6作為白細胞介素家族的一員，屬于促炎因子[11]。當機體出現(xiàn)炎性反應時，可以轉導細胞內(nèi)信號，誘導細胞產(chǎn)生急性期反應蛋白，同時對其它炎性因子起到趨化、聚集的作用。它協(xié)同TNF-α、IL-2等細胞因子誘導T/B淋巴細胞的分化、增殖，還促使IL-3對多向祖細胞的誘導與分化[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6也可以通過細胞內(nèi)STAT3信號通路調(diào)節(jié)細胞的生長和凋亡[13]。IL-13屬于白細胞介素-1家族，在感染應答刺激下，由內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、單核細胞等炎性細胞產(chǎn)生和釋放，通過激活IL-2、血小板生長因子、集落刺激因子等因子參與免疫應答，促進B淋巴增殖及分泌。在我們的實驗中，細胞因子TNF-α、IL-6、IL-13在3組膿毒癥患者治療前均呈現(xiàn)高表達，相同時段，反映肝腎功能的指標ALT、AST、TB、IB、Cr、BUN也都明顯高于正常值。充分證明了膿毒癥臟器功能損傷與炎性因子的體內(nèi)濃度明顯相關。

WBC、CRP、PCT是臨床常用于診斷感染的指標。WBC反應機體對炎性反應的能力，當出現(xiàn)中度以上感染時，WBC明顯上升，常常同時伴有核左移。CRP由肝臟產(chǎn)生，受TNF-α、IL-6等因子的調(diào)節(jié)，在感染后，在體內(nèi)的濃度迅速上升，作為炎性反應急性期時相蛋白，可用于評估患者病情輕重及轉歸。PCT是降鈣素的無活性肽鏈，由116個氨基酸組成[14]。譚德敏等[15]對9 846 例按照美國重癥醫(yī)學會/歐洲危重癥醫(yī)學會發(fā)布的拯救膿毒癥運動(2016)標準診斷為膿毒癥的患者進行了研究，結果顯示PCT對膿毒癥診斷的特異性為0.75，敏感性為0.81。

SOFA、APACHEⅡ在臨床上常用于對患者臟器功能的評估，該評分系統(tǒng)具有操作簡單、持續(xù)動態(tài)、無創(chuàng)可靠、容易觀察等特點。評分高低與患者病情危重程度成正相關，不僅描述了多臟器功能衰竭患者的病理發(fā)展過程，而且對患者預后進行準確的預測。為臨床快速診斷和治療提供了量化指標。

目前，膿毒癥的治療效果差，臨床病死率高，并且治療花費大，膿毒癥治療的方法包括：以液體復蘇為主的目標導向治療(EGDT)、血管活性藥物、抗生素、激素等，但仍不能顯著的提高治愈率，究其原因，是炎性因子網(wǎng)絡和炎癥級聯(lián)反應的復雜性導致的。

連續(xù)靜脈-靜脈血液濾過(continuous veno venous hemofiltration,CVVH)屬于腎臟替代治療的一種，它采用高分子濾膜過濾器，利用血液對流的原理清除體內(nèi)中小分子毒物，如BUN、Cr等，同時它還可以清除體內(nèi)的細胞因子和炎性介質(zhì)，調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡紊亂，模擬正常腎臟對血液的濾過作用，精準的對機體內(nèi)環(huán)境進行調(diào)控，因此被廣泛應用于急危重癥的治療。本研究結果顯示，血濾組患者SOFA、APACHEⅡ評分均降低，血液中WBC、CRP、PCT和炎性因子TNF-α、IL-6、IL-13也顯著下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

烏司他丁是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，對機體內(nèi)多種酶，包括各種糖蛋白酶、纖溶酶、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶等都具有良好的抑制作用。動物實驗及臨床研究顯示，烏司他丁具有清除機體氧自由基、抑制炎性因子的產(chǎn)生、釋放、阻斷炎性聯(lián)連反應的作用，在膿毒癥休克、DIC、MODF等全身性疾病中可以有效抑制單核巨噬細胞、淋巴細胞的激活，改善組織微循環(huán)及血液灌注，從而保護各個臟器功能[16]。

血液濾過聯(lián)合烏司他丁不僅能夠加強炎性細胞因子的清除，阻斷全身炎性反應，而且還能清除尿素、肌酐等體內(nèi)毒素，濾出體內(nèi)多余的水分，對臟器功能起到保護作用。兩者結合可以優(yōu)勢互補、強化清除效應，有利于改善病情。本試驗中聯(lián)合治療組患者臟器功能評分SOFA、APACHEⅡ以及炎性指標WBC、CRP、PCT均低于對照組和血濾組，肝腎功能較對照組和血濾組明顯改善，機體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-13的含量下降顯著，與對照組、血濾組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

綜上所述，血液濾過聯(lián)合烏司他丁是針對膿毒癥發(fā)病機制進行的多中心、多靶點的綜合治療，其不僅阻止了細菌產(chǎn)物及炎性細胞因子的產(chǎn)生和釋放，而且還能清除體內(nèi)的毒素和代謝產(chǎn)物，有效的改善了患者的器官功能，降低了膿毒癥患者的病死率，在臨床上療效確切，不良反應少，值得推廣。