lncRNA TINCR靶向調控miR-221抑制大鼠心肌細胞凋亡的實驗研究

李雨彌， 章 培， 唐 勇， 谷 子， 張文勇

(四川省成都市第二人民醫(yī)院, 四川 成都 610017)

在慢性心衰、動脈粥樣硬化和缺血性心臟病等心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中存在著心肌細胞凋亡現象，而它導致的心肌細胞數目減少是引起心肌結構異常、心臟功能紊亂的重要因素之一[1]；因此，深入了解心肌細胞凋亡的分子機制對有效抑制其發(fā)生進而改善心血管疾病具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個氨基酸的RNA分子，不具有編碼蛋白質的功能，可作為微小RNA(microRNA，miRNA)的前體，可通過與miRNA競爭性結合靶基因信使mRNA(mRNA)的3'非翻譯區(qū)(Untranslated Region，UTR)和“海綿效應”等機制調控miRNA的表達，在基因轉錄和轉錄后水平以及表觀遺傳學等方面發(fā)揮著重要作用，與心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關[2,3]。近年來，有研究[4]指出，lncRNA組織分化誘導非蛋白編碼RNA(tissue differentiation inducing non-protein coding RNA，TINCR)在糖尿病心肌病患者心肌活檢和血清中表達下調，且具有抑制心肌細胞凋亡的作用，但具體的調控機制并不完全清楚。miR-221是一種在人類細胞和組織中發(fā)現較早和存在較為廣泛的miRNA，除了與腫瘤的發(fā)生有關外，還可通過影響心肌細胞凋亡參與心血管疾病的發(fā)生[5]。本研究采用生物信息學軟件預測發(fā)現TINCR 3'UTR與miR-221存在互補的結合位點，猜測TINCR可能通過靶向調控miR-221表達發(fā)揮抑制心肌細胞凋亡的作用。為了驗證上述猜想，本研究開展體外細胞實驗加以驗證。

1 材料與方法

1.1主要材料:大鼠心肌細胞系H9c2(中科院細胞庫)，二甲基亞砜試劑(美國Sigma)，逆轉錄試劑盒和熒光定量聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(大連Takara)，RNA提取試劑Trizol、脂質體(Lipofectamine)?3000轉染試劑和DMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen)，胎牛血清和胰蛋白酶(美國Gibco)， B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)抗體(美國Abcam)?？偟鞍滋崛≡噭┖?美國Sigma-Aldrich)，膜聯蛋白 V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細胞凋亡雙染試劑盒(上海復申生物)，熒光素酶報告基因檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)。psiCHECK-2熒光素酶報告載體(上海海吉浩格生物)，pcDNA3.1-TINCR過表達質粒及其對照pcDNA3.1空載體質粒(上海吉滿生物)，miR-221模擬物及其陰性對照(negative control，NC)(上海吉瑪生物)，實時熒光定量PCR儀(美國ABI)，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher)，酶標儀(美國Molecular Devices)，流式細胞儀(美國BD)。

1.2細胞培養(yǎng)、實驗分組與脂質體轉染:H9c2細胞使用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)、37℃、飽和濕度、5%二氧化碳條件下的培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。TINCR影響心肌細胞實驗：實驗分為①對照組：正常培養(yǎng)；②pcDNA3.1組：轉染pcDNA3.1空載體質粒；③TINCR組：轉染pcDNA3.1-TINCR過表達質粒；④si-NC組：轉染si-NC；⑤si-TINCR組：轉染TINCR小干擾RNA si-TINCR。miR-221影響心肌細胞實驗：實驗分為①miR-NC組：轉染miR-221模擬物陰性對照miR-NC；②miR-221組：轉染miR-221模擬物；③anti-miR-NC組：轉染miR-221抑制劑陰性對照anti-miR-NC；④anti-miR-221組：轉染miR-221抑制劑anti-miR-221；⑤pcDNA3.1組：處理同上；⑥TINCR組：處理同上；⑦TINCR+miR-NC組：將pcDNA3.1-TINCR過表達質粒和miR-221模擬物陰性對照miR-NC共轉染至心肌細胞；⑧TINCR+miR-221組：將pcDNA3.1-TINCR過表達質粒和miR-221模擬物共轉染至心肌細胞中；其中，每組設置3個平行孔。當對數生長期的心肌細胞接種于6孔細胞板，2×105個細胞/孔，常規(guī)培養(yǎng)至融合度達75%左右時，根據實驗分組參照轉染試劑Lipofectamine?3000說明書將2μg pcDNA3.1空載體質粒和pcDNA3.1-TINCR過表達質粒或50nmoL/L miR-221模擬物或miR-NC轉染至心肌細胞中。轉染48h后，收集各組細胞，分別采用實時熒光定量PCR檢測心肌細胞中TINCR和miR-221的表達水平以評價轉染效果，MTT法和流式細胞術分別檢測細胞活力和凋亡情況，免疫印跡法檢測細胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達。

1.3實時熒光定量PCR檢測TINCR和miR-221的表達:通過Trizol法進行心肌細胞總RNA的提取，采用逆轉錄試劑盒將RNA進行逆轉錄；以逆轉錄產物為模板，根據實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR擴增。其中，反應條件為：94℃預變性5min后，進行40個循環(huán)階段：94℃變性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s。分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和U6為內參，根據2-△△Ct法計算心肌細胞中TINCR和miR-221的表達水平。PCR引物序列(合成自上海生工生物工程公司)見表1。

表1 PCR引物序列

1.4雙熒光素酶報告基因實驗檢測TINCR和miR-221的靶向關系:運用DIANA-LncBase Predicted v.2軟件預測到TINCR 3'UTR與miR-221存在互補的結合位點；為了進一步驗證TINCR和miR-221的靶向結合關系，將TINCR 3'UTR片段克隆擴增至psiCHECK-2熒光素酶載體上，構建TINCR野生型(TINCR-WT)載體質粒；而將TINCR 3'UTR與miR-221結合位點定點突變后，克隆重組至熒光素酶載體上，構建TINCR突變型(TINCR-MUT)載體質粒；參照Lipofectamine?3000說明書將4.0 μg TINCR-WT和TINCR-MUT質粒分別與50 nmoL/L miR-221、miR-NC共轉染到心肌細胞。遵循熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書的指示，檢測心肌細胞轉染48h后的熒光素酶活性。

1.5噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)法檢測細胞活力 將轉染成功后的心肌細胞和正常培養(yǎng)的心肌細胞接種至96孔細胞板，105個細胞/孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL 0.5% MTT溶液孵育4 h；再以150 μL的二甲基亞砜搖床震蕩反應10 min后，上酶標儀在490nm波長處檢測各組細胞的吸光值。按照公式：細胞存活率(%)=(實驗組吸光值/對照組吸光值)×100%計算各組細胞存活率。

1.6流式細胞術分析細胞凋亡:轉染成功后的心肌細胞經磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗滌2次后，加入400 μL的結合緩沖液，將其濃度調整為105個/mL，吸取100 μL于離心管，依次加入5 μL Annexin-V-FITC、5 μL PI工作液，避光染色15 min。之后補加200 μL 結合緩沖液，置于流式細胞儀進行各組細胞凋亡的檢測。

1.7免疫印跡法檢測細胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達:利用總蛋白提取試劑盒抽提提取心肌細胞的總蛋白，將蛋白樣品進行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離后的蛋白電轉至聚偏二氟乙烯膜。膜以脫脂奶粉(5%)封閉，2h后加入以1∶1 000比例稀釋的Bcl-2、Bax和內參GAPDH抗體，4℃孵育12h；次日，加入以1∶2000比例稀釋的二抗，在室溫下孵育，2h后滴加化學發(fā)光劑，顯影、曝光，采用美國Bio-Rad的凝膠成像系統掃描分析心肌細胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達水平。

2 結 果

2.1TINCR可與miR-221靶向結合:采用生物信息學軟件預測到TINCR 3'UTR區(qū)域部分堿基序列可與miR-221互補配對，結果見圖1。采用熒光素酶實驗進行驗證，miR-221模擬物與構建的TINCR-WT共轉染后細胞的熒光素酶活性較相應對照miR-NC組明顯降低(P<0.05)；但miR-221與構建的TINCR-MUT共轉染后細胞的熒光素酶活性與對照miR-NC組之間差異無統計學意義(P>0.05)，結果見表2。qRT-PCR檢測結果如表3所示，與si-NC組比較，si-TINCR組miR-221的表達水平明顯升高(P<0.05)；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-TINCR組miR-221的表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 TINCR 3'UTR區(qū)域存在與miR-221互補的結合位點

表2 各組細胞熒光素酶活性的比較

2.2TINCR過表達可抑制大鼠心肌細胞中miR-221的表達:實時熒光定量PCR檢測TINCR過表達對miR-221的調控作用，結果見表4。與對照組比較，轉染TINCR過表達質粒后心肌細胞中TINCR的表達水平明顯升高，而miR-221的表達水平明顯降低(P<0.05)；但轉染空載體的pcDNA3.1組細胞中TINCR和miR-221的表達水平與對照組之間差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3TINCR過表達可提高大鼠心肌細胞活力:采用MTT法檢測TINCR過表達對大鼠心肌細胞活力的影響，結果見表5。與對照組比較，在TINCR表達上調的TINCR組中存活率明顯增加(P<0.05)，但細胞存活率在pcDNA3.1組與對照組兩組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 qRT-PCR檢測miR-221的表達

表4 轉染后心肌細胞中TINCR和miR-221表達水平的比較

表5 各組細胞存活率的比較

2.4TINCR過表達可抑制大鼠心肌細胞凋亡:采用流式細胞術觀察TINCR過表達對大鼠心肌細胞凋亡的影響，結果見圖2和表5。與對照組比較，TINCR組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，而pcDNA3.1組與對照組之間細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 流式細胞術檢測TINCR過表達對大鼠心肌細胞凋亡的影響

2.5TINCR過表達上調大鼠心肌細胞凋亡中Bcl-2蛋白并下調Bax蛋白的表達:采用免疫印跡法進一步檢測TINCR過表達對大鼠心肌細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達情況，結果見圖3和表6。與對照組比較，TINCR組細胞中Bcl-2蛋白的表達水平明顯升高，且Bax蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05)；但pcDNA3.1組與對照組兩組細胞中Bcl-2和Bax的蛋白表達差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖3 免疫印跡法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達

表6 各組細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平的比較

2.6miR-221對大鼠心肌細胞凋亡的影響:轉染miR-221模擬物或抑制劑后觀察miR-221對大鼠心肌細胞凋亡的影響，結果見圖4和表7。與miR-NC組比較，miR-221組中miR-221表達水平、凋亡率和Bax蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；相較于anti-miR-NC組，anti-miR-221組中miR-221表達水平、凋亡率和Bax蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。

圖4 免疫印跡法檢測各組中Bcl-2和Bax蛋白的表達

表7 miR-221對大鼠心肌細胞凋亡的影響

2.7上調miR-221表達可逆轉TINCR過表達對大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用:轉染miR-221模擬物后觀察miR-221表達對TINCR過表達的大鼠心肌細胞的影響，結果見圖5和表8。與pcDNA3.1組比較，TINCR組中miR-221表達水平和凋亡率明顯降低，而細胞存活率明顯升高(P<0.05)；與TINCR組比較，在轉染miR-221模擬物的TINCR+miR-221組中miR-221的表達水平和細胞凋亡明顯升高，而細胞存活率明顯降低(P<0.05)；但在轉染陰性對照的TINCR+miR-NC組中miR-221表達水平、細胞存活率和細胞凋亡率與TINCR組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖5 miR-221對大鼠心肌細胞凋亡的影響

表8 各組細胞中miR-221表達細胞存活率和細胞凋亡率的比較

3 討 論

心血管疾病是全球最大的公共衛(wèi)生問題，我國該病的發(fā)病率和死亡率呈升高趨勢，嚴重威脅著人們的身體健康[6]；因此，深入探討其發(fā)病的相關機制尋找有效的對策刻不容緩。心肌細胞凋亡是引起心力衰竭和心室重構等重要因素，抑制其發(fā)生對心肌損傷和心功能改善具有重要意義。在心血管疾病中存在著異常表達的lncRNAs，而這些lncRNAs可能在心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，而特異性干擾其表達可能是改善心血管疾病的重要策略[7,8]。例如：在慢性心力衰竭患者血漿中生長停滯相關的lncRNA1(Growth arrest associated lncRNA 1，GASL1)表達下調，而上調GASL1表達可通過抑制轉化生長因子β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)的活化減少心肌細胞凋亡而改善慢性心力衰竭[9]。在缺血再灌注損傷和過氧化氫處理中l(wèi)ncRNA(five prime to Xist，FTX)呈現低表達，FTX表達增強可通過調控miR-29b-1-5p/BCL2L2表達抑制心肌細胞凋亡，其可能是治療心肌細胞凋亡相關心臟疾病的新途徑[10]。在臨床心力衰竭樣本和心肌梗死大鼠心肌組織中發(fā)現lncRNA母系表達基因3(maternal expressed gene3，MEG3)表達增加，功能實驗揭示了MEG3具有促進心肌細胞凋亡的作用，以攜帶MEG3-shRNA的腺相關病毒9型系統注射心肌后，心力衰竭小鼠的心功能顯著改善，特異性敲低MEG3被認為是一種很有前景的治療心肌梗死策略。

TINCR是一種與表皮細胞分化密切相關的lncRNA，其異常表達可通過與多種分子相互作用，參與胃癌、乳腺癌和肝癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來，有學者[4]指出，TINCR在糖尿病心肌病患者心肌活檢和血清中表達下調，且具有抑制心肌細胞凋亡的作用，但具體的作用機制并不完全清楚。miRNAs是一類長度約18～25個氨基酸的單鏈非編碼RNA，可通過與lncRNA相互作用，參與包括心血管疾病在內的多種疾病的發(fā)生發(fā)展。miR-221是miRNAs家族成員，其異常表達除了與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關外，還可通過調控促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達影響心肌細胞凋亡，與急性心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生密切相關。本研究采用生物信息學軟件預測到TINCR 3'UTR與miR-221存在互補的結合位點，采用雙熒光素酶報告基因實驗證實現TINCR 3'UTR可與miR-221靶向結合；同時，上調TINCR表達后發(fā)現，大鼠心肌細胞中miR-221表達水平明顯降低，下調TINCR表達時miR-221表達水平顯著升高。結果表明，TINCR可靶向調控miR-221表達。此外，上調TINCR表達后還發(fā)現，大鼠心肌細胞凋亡、Bax蛋白的表達被抑制，而細胞增殖、Bcl-2蛋白的表達被促進。該結果進一步驗證了前人[4]所得出的TINCR具有抑制心肌細胞凋亡的作用；此外，還得出了該作用與TINCR上調Bcl-2和下調Bax蛋白的表達有關。另外，轉染miR-221模擬物成功上調miR-221表達后發(fā)現，Bcl-2蛋白表達下調，而細胞凋亡率和Bax蛋白表達升高；轉染miR-221抑制劑成功下調miR-221表達具有相反的結果。另外，上調miR-221表達后，TINCR表達上調對心肌細胞凋亡的抑制作用得到逆轉。這提示，TINCR可通過靶向調控miR-221抑制心肌細胞凋亡。

綜上所述，TINCR可以抑制心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的抑制作用，其作用機制可能與靶向調控miR-221表達有關。該結果進一步闡述了TINCR調控心肌細胞凋亡中的分子機制，也為以TINCR為靶點的心肌細胞凋亡相關心血管疾病的治療提供了新的參考依據。