大蒜素對白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的影響研究

熊延靖 厲榮玉 吳艷紅

(皖南醫(yī)學院 醫(yī)學微生物學與醫(yī)學免疫學教研室，蕪湖 241002)

白念珠菌(Candidaalbicans)，亦稱白假絲酵母菌，是一種二相性真菌，從形態(tài)上可分為酵母相和菌絲相。在相關誘導因素的作用下，白念珠菌可發(fā)生由酵母相到菌絲相的轉(zhuǎn)換過程。研究證實，白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換實際上是其由定植菌向致病菌轉(zhuǎn)變的一種標志[1-2]，菌絲的形成可以提高白念珠菌對機體的侵襲力和黏附能力[3]。菌絲型生長通常與高水平的毒力因子相關聯(lián)，如促進生物被膜的形成，產(chǎn)生分泌性的裂解酶以及抗氧化酶等。這些都有助于白念珠菌發(fā)生組織穿透、侵襲并抵抗宿主的免疫攻擊[4-5]。因此，研究如何抑制酵母相和菌絲相的形態(tài)轉(zhuǎn)換對于抗白念珠菌感染具有重要意義。

大蒜是天然的植物廣譜抗菌素，其中發(fā)揮主要作用的成分是大蒜素。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對多種細菌、真菌和病毒等均有不同程度的抑制和殺滅作用，是當前發(fā)現(xiàn)的天然植物中抗菌作用最強的一種[6-7]。本課題組在先前的實驗中發(fā)現(xiàn)，大蒜素在體外對白念珠菌活性有較強的抑制作用[8]。因此，本研究選用大蒜素作為干預藥物，探討其對白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的影響及作用機制，為臨床抗白念珠菌感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株 白念珠菌標準菌株：AX2-2086，購自廣州市微生物研究所。將菌株在改良沙堡弱固體培養(yǎng)基中連續(xù)接種兩次，保持菌株活力，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑 二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，PBS磷酸鹽緩沖液(biosharp)，RPMI-1640培養(yǎng)基(biosharp)，葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司)，營養(yǎng)肉湯(Solarbio)，蛋白胨(Solarbio)，甘露醇(國藥集團化學試劑有限公司)，瓊脂粉(北京奧博星生物技術有限責任公司)。RNA提取試劑盒(OMEGA Yeast RNA Kit)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit)，qRT-PCR試劑盒(Roche FastStart Essential DNA Green Master)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)。

藥物 大蒜素(江蘇正大清江制藥有限公司，批準文號：國藥準字H32025683，產(chǎn)品批號：190307)。

培養(yǎng)基 ①改良沙堡弱培養(yǎng)基：稱取葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，加入雙蒸水定容至1 L，112℃高壓滅菌15 min，即為改良沙堡弱液體培養(yǎng)基。若制備改良沙堡弱固體培養(yǎng)基，則在上述改良沙堡弱液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g再高壓滅菌。4℃保存?zhèn)溆?。②Spider培養(yǎng)基：稱取營養(yǎng)肉湯10 g，甘露醇10 g，K2HPO42 g，加入雙蒸水定容至1 L，調(diào)整pH為7.2(25℃)，121℃高壓滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要儀器 生物安全柜：ESCO CLASSⅡ BSC；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZQZY-VS2)：上海知楚儀器有限公司；高速冷凍離心機：BECKMAN Allegra 64R；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：THERMOFISHER IMH100；FA2004型電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；微量培養(yǎng)板(96孔，6孔)：美國Coring公司；純水機：ELGA Purelabflex 2；倒置顯微鏡：日本OLYMPUS公司；核酸蛋白分析儀：BioDrop；全波長酶標儀：Biotek Eon；熒光定量PCR儀：Roche lighelycler 96。

1.2 實驗方法

菌液制備 將白念珠菌標準菌株AX2-2086接種于改良沙堡弱固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h后，挑取單克隆菌落，轉(zhuǎn)種至5 mL改良沙堡弱液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，使白念珠菌處于對數(shù)生長期。血細胞計數(shù)板計數(shù)， RPMI-1640培養(yǎng)液將菌液調(diào)整至濃度為2×106CFU /mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

藥液配制 將大蒜素溶解于DMSO中，用RPMI-1640培養(yǎng)液進行倍比稀釋，使其濃度為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

白念珠菌菌絲形成的體外動力學檢測 用Spider液體培養(yǎng)基將白念珠菌菌液稀釋至2×106CFU/mL，取菌液3 mL加入6孔板中，37℃靜置孵育。分別于培養(yǎng)的0 h、2 h、6 h、12 h、24 h取出孔板，在倒置顯微鏡明場下觀察白念珠菌菌絲形成情況并拍照。

大蒜素對白念珠菌最低抑菌濃度(MIC)的測定 采用美國臨床和實驗室標準化研究所(CLSI)推薦的真菌敏感性檢測方法CLSI-M27-A3[9]，按照微量液基稀釋法操作步驟進行并略作改良。具體方法如下：①用RPMI-1640培養(yǎng)液將白念珠菌菌液稀釋至2×103CFU /mL。②將上述濃度的大蒜素溶液和菌液各100 μL加入96孔微量培養(yǎng)板中，使得大蒜素和菌液分別被1∶1稀釋至終濃度。同時設生長對照孔(RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL+菌液100 μL)和空白對照孔(RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL)。每個濃度均設3復孔。③將96孔微量培養(yǎng)板置37℃培養(yǎng)48h后觀察結果。以上實驗在不同時間重復3次。④結果判斷：視覺法判定，肉眼觀察孔內(nèi)白念珠菌的生長情況，與生長對照孔相比，觀察到生長完全抑制、培養(yǎng)基清亮所對應的最低藥物濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。

大蒜素對白念珠菌菌絲形態(tài)的影響 檢測大蒜素對白念珠菌在Spider液體培養(yǎng)基中菌絲形成的影響。實驗步驟為：①用Spider液體培養(yǎng)基將白念珠菌稀釋至2×106CFU /mL。②將菌液和終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的大蒜素加入6孔板中。同時設立不加藥物的空白對照孔?；靹蚝?7℃靜置孵育。③分別于培養(yǎng)的2 h、6 h、12 h、24 h取出孔板，在倒置顯微鏡明場下觀察白念珠菌菌絲形成情況并拍照。

qRT-PCR檢測大蒜素對菌絲形成相關基因表達的影響 ①總RNA提?。簩⒔K濃度依次為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的大蒜素與菌液(2×106CFU /mL)混勻，置37℃培養(yǎng)24 h后，收集菌體，用無菌PBS緩沖液清洗3次，提取白念珠菌總RNA，操作步驟按照試劑盒說明書進行。②引物的設計與合成[10]：所用引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。③cDNA的制備：根據(jù)TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。第一步：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNA 1 μg，加RNase Free dH2O至10 μL，反應條件為42℃ 2 min。第二步：第一步反應液10 μL，Master Mix 10 μL，反應條件為37℃ 15 min、85℃ 5 s。④實時熒光定量PCR反應：按照Roche FastStart Essential DNA Green Master試劑盒說明，配制反應體系見表2。將所有試劑加好后，放置于熒光定量PCR儀中進行反應，反應條件為：預變性95℃ 600 s；擴增定量程序為：95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，擴增程序為40個循環(huán)；熔解曲線(melting curve)65～95℃。每個樣品均設置3個重復。⑤定量分析：qRT-PCR分別測定的目的基因和內(nèi)參基因的CT值，將實驗結果取平均值，計算并統(tǒng)計?；虮磉_水平用2-△△CT法進行分析。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Primers used for qRT-PCR

表2 PCR反應體系Tab.2 The reaction system of PCR

2 結 果

2.1 白念珠菌菌絲形成的動態(tài)過程

通過倒置顯微鏡分別觀察了培養(yǎng)0 h、2 h、6 h、12 h、24 h白念珠菌在Spider液體培養(yǎng)基中菌絲形成的過程(見圖1)。結果發(fā)現(xiàn)，白念珠菌在培養(yǎng)的2 h左右開始形成芽生孢子。隨后6 h出現(xiàn)大量菌絲，至12 h菌絲交織在一起形似網(wǎng)狀結構。24 h后鏡下可見大量白念珠菌菌絲緊密交錯。

圖1 白念珠菌菌絲形成動態(tài)過程(×400)Fig.1 The dynamic formation process of Candida albicans hyphae(×400)

2.2 大蒜素對白念珠菌的MIC值

采用CLSI-M27-A3推薦的微量稀釋法，檢測得出大蒜素對白念珠菌標準菌株AX2-2086的MIC為25 μg/mL。根據(jù)MIC值的實驗結果，設置后續(xù)實驗中大蒜素終濃度依次為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL。

2.3 觀察大蒜素對白念珠菌菌絲形態(tài)的作用

通過倒置顯微鏡觀察大蒜素對白念珠菌菌絲形成的影響，結果顯示，未經(jīng)藥物處理的白念珠菌能在6 h內(nèi)形成較長的菌絲，至12 h鏡下觀察到菌絲錯綜復雜，相互纏繞重疊。24 h可見大量菌絲相細胞包裹著酵母相細胞，菌體交錯密集，結構致密。當加入25 μg/mL濃度的大蒜素時，視野內(nèi)可觀察到不同時間點菌絲長度均明顯變短，且與對照組相比數(shù)量明顯減少。而100 μg/mL濃度的大蒜素則能夠基本抑制菌絲的生長，鏡下觀察以酵母相細胞為主。這一現(xiàn)象說明，大蒜素能夠抑制白念珠菌由酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)化，且這種抑制作用具有一定的劑量依賴性，即隨著大蒜素濃度的升高，抑制作用更加明顯。見圖2。

圖2 不同濃度大蒜素對白念珠菌菌絲形態(tài)的作用 (×400)Fig.2 Effect of allicin in different concentration on hyphae morphology of Candida albicans (×400)

2.4 大蒜素對白念珠菌菌絲形成相關基因表達的影響(見圖3)

圖3 大蒜素對白念珠菌菌絲相關基因表達的影響Fig.3 The effect of allicin on gene expression of Candida albicans hyphae

與空白對照組相比，在≥25 μg/mL濃度的大蒜素干預作用下，參與正向調(diào)控白念珠菌菌絲生長的基因HWP1、ALS1、EFG1的表達均明顯下降，而負向調(diào)控菌絲生長的基因PDE2的表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結果提示，大蒜素對白念珠菌菌絲生長的作用機制可能是通過抑制正向調(diào)控基因的表達，上調(diào)負向調(diào)控基因的表達，從而抑制菌絲的形成。

3 討 論

白念珠菌具有形態(tài)的多樣性，其中酵母相-菌絲相的形態(tài)轉(zhuǎn)換是其典型的形態(tài)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)。白念珠菌這種形態(tài)的可塑性，是其毒力的關鍵決定因素之一[11]。菌絲相的形成在對宿主的黏附和致病過程中起重要作用[12]。菌絲能通過誘導胞吞作用，主動穿透宿主的表皮細胞，逃避機體免疫監(jiān)管，造成黏膜損傷[13]。相關研究表明，白念珠菌酵母相細胞常定植于皮膚或黏膜表面，通常不引起宿主的免疫反應，易通過血液循環(huán)進行傳播。當宿主免疫功能受損或體內(nèi)菌群失衡時，白念珠菌由酵母相轉(zhuǎn)換為菌絲相，更易發(fā)生黏附和侵襲，具有較強的致病能力。

Spider培養(yǎng)基常被用來評估白念珠菌維持菌絲生長的能力[14]。菌絲相白念珠菌呈無縊縮的長管狀多細胞形態(tài)。在本實驗中，將白念珠菌標準菌株AX2- 2086接種到Spider液體培養(yǎng)基中，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)白念珠菌在培養(yǎng)的6 h出現(xiàn)大量菌絲，至12 h長且密的菌絲相互纏繞重疊，交織在一起形似網(wǎng)狀結構。說明Spider液體培養(yǎng)基能夠良好誘導白念珠菌菌絲相的形成。

大蒜素是從百合科植物大蒜的鱗莖中提取的含硫有機化合物的主要有效成分。研究顯示大蒜素對多種細菌、真菌、病毒和寄生蟲等均具有良好的抑制作用，被譽為天然廣譜抗生素[15-16]。本研究觀察了大蒜素對白念珠菌菌態(tài)轉(zhuǎn)換表觀和相關基因表達的影響，以探討其抑制作用及分子調(diào)節(jié)機制。通過倒置顯微鏡觀察，當加入25 μg/mL濃度的大蒜素后，視野內(nèi)可觀察到菌絲長度明顯變短，且與對照組相比數(shù)量明顯減少。而100 μg/mL濃度則能基本抑制菌絲的生長，鏡下觀察以酵母相細胞為主。以上觀察結果提示，大蒜素能夠抑制白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，當大蒜素濃度足夠高時，可使白念珠菌停留在酵母相。

目前研究發(fā)現(xiàn)，宿主相關環(huán)境因素作用于白念珠菌，激活相應的信號傳導通路，調(diào)控下游應答基因的表達，共同調(diào)控白念珠菌菌絲發(fā)育。Ras-cAMP-Efg1途徑是調(diào)節(jié)白念珠菌由酵母相到菌絲相轉(zhuǎn)化的重要信號通路之一，通過 Ras1激活 cAMP/PKA信號傳導通路，磷酸化并激活下游相應的轉(zhuǎn)錄因子(如Efg1和Flo8等)，調(diào)控白念珠菌菌絲的生長[17]。白念珠菌中存在兩種 Ras蛋白——Ras1和Ras2，其中Ras1蛋白是白念珠菌菌絲生長和毒力所必需的。研究發(fā)現(xiàn)，敲除RAS1基因的菌株菌絲發(fā)育缺陷、毒力顯著降低[18]。第二信使cAMP是該信號通路重要的調(diào)控分子，cAMP由Cdc35酶合成，Pde2酶降解[19]。為驗證大蒜素對白念珠菌菌絲形成的作用機制，實驗進一步通過qRT-PCR檢測了菌絲相關基因的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，大蒜素能夠下調(diào)與菌絲形成正相關基因(RAS1、CDC35、EFG1)的表達，上調(diào)菌絲形成負相關基因(PDE2)的表達。由此可見，大蒜素對白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換具有明顯抑制作用，其抑制作用的分子調(diào)節(jié)機制可能是通過下調(diào)與菌絲形成正相關基因的表達并上調(diào)負相關基因的表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，大蒜素可抑制白念珠菌絲的形成和形態(tài)轉(zhuǎn)換，表明大蒜素在抗白念珠菌感染方面具有良好應用前景。在本實驗基礎上，將進一步建立白念珠菌感染的動物模型，探討大蒜素在體內(nèi)對白念珠菌菌絲的形成和對宿主的侵襲作用的影響，為白念珠菌感染的治療和新型抗真菌藥物的研發(fā)提供理論基礎。