暗色真菌感染病原學(xué)診斷方法和治療藥物研究進(jìn)展

景丹蕤 李筱芳,2 劉維達(dá)，2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，南京 210042；2.江蘇省皮膚病與性病學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210042)

暗色真菌是一組孢子和/或菌絲的壁具有黑色素樣顏色的真菌，是一種廣泛存在于自然界的腐生寄生生物，包括大約70個(gè)屬和150個(gè)種[1]。暗色真菌可引起皮膚組織和內(nèi)部臟器深部真菌感染，導(dǎo)致著色芽生菌病、暗色絲孢霉病和足菌腫等。此類感染致病菌種類繁多，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，診斷和治療較為困難。病原菌準(zhǔn)確和快速的鑒定有助于早期明確診斷，新的抗真菌藥物的研發(fā)可幫助臨床工作者對暗色真菌的感染更加合理地選擇治療藥物。本文將圍繞暗色真菌感染病原學(xué)診斷方法和治療藥物研究的進(jìn)展作一綜述。

1 病原學(xué)診斷方法的研究進(jìn)展

組織病理切片和真菌培養(yǎng)是傳統(tǒng)的暗色真菌感染的病原學(xué)確診手段，前者通常被視為其金標(biāo)準(zhǔn)。但這種基于表型特征的形態(tài)學(xué)鑒定對鑒定人員的素質(zhì)要求較高，且周期較長，在大多數(shù)時(shí)候僅能鑒定到屬水平，不能滿足臨床早期特異性診斷的要求。近年來分子鑒定、MALDI-TOF MS(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry)等的應(yīng)用大大提高了暗色真菌檢測的敏感度，縮短了鑒定時(shí)間，還可深入提供致病菌的分型、耐藥基因和毒力因子分析等，具有傳統(tǒng)診斷方法不可比擬的優(yōu)勢，可更好地指導(dǎo)個(gè)體化治療。

1.1 分子鑒定技術(shù)

隨著現(xiàn)代生物學(xué)的進(jìn)步，對暗色真菌核糖體DNA(rDNA) D1/D2區(qū)域和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)的序列分析已成為鑒定暗色真菌的有效手段[2,3]，特別是ITS區(qū)域已被廣泛地視為暗色真菌分類的通用條形碼[4]。此外，β-微管蛋白、肌動(dòng)蛋白、鈣調(diào)蛋白、錳超氧化物歧化酶、ATP酶亞基6、幾丁質(zhì)合成酶、線粒體小亞基rRNA和真核延伸因子-1α等基因的測序也可用于鑒別菌種[5]。但尚未見比較不同基因序列鑒定不同種屬暗色真菌的特異性和敏感性的研究報(bào)道。此外，分子鑒定具有耗時(shí)短、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但由于現(xiàn)有GenBank數(shù)據(jù)庫的信息有限及編碼暗色真菌黑色素的DNA 片段可抑制PCR擴(kuò)增[6,7]，因此，分子鑒定在識(shí)別部分菌種時(shí)仍存在困難。如Singh等[6]從印度19個(gè)醫(yī)療中心的患者中分離出72株共21屬，29種暗色真菌，利用ITS、D1/D2區(qū)域和β-微管蛋白標(biāo)記僅鑒定出其中90%的菌種，對Corynespora屬和Rhytidhysteron屬的4株分離株無法將其鑒定到種的水平。

1.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)

MALDI-TOF MS作為一種準(zhǔn)確、可靠、快速的診斷技術(shù)，其所花費(fèi)的時(shí)間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于DNA測序所用時(shí)間[8]。在Singh等[6]的研究中，使用MALDI-TOF MS僅鑒定出29種暗色真菌中的6種(20%)，這可能與其使用的Bruker數(shù)據(jù)庫菌種信息的有限性(僅包含16屬25種暗色真菌)有關(guān)。但通過將該研究中其他未收錄在Bruker數(shù)據(jù)庫中的菌株置于沙堡弱葡萄糖液體培養(yǎng)基中生長24～96 h，使用乙醇-甲酸萃取法來提取蛋白質(zhì)，最后用MALDI-TOF MS Biotyper OC系統(tǒng)(版本 3.1)鑒定菌株并創(chuàng)建內(nèi)部數(shù)據(jù)庫，該研究成功鑒定了另外14屬20種暗色真菌。Paul等[8]在此基礎(chǔ)上改進(jìn)了蛋白提取方案，通過納入59株共20屬，26種暗色真菌來創(chuàng)建內(nèi)部數(shù)據(jù)庫。并用117株暗色真菌進(jìn)行驗(yàn)證，達(dá)到了100%的識(shí)別率。經(jīng)過檢測，MALDI-TOF質(zhì)譜的總體準(zhǔn)確性與DNA測序相當(dāng)。此外，在Paul等的觀察中，發(fā)現(xiàn)基于DNA測序鑒定菌株需花費(fèi)5～9 d，而通過MALDI-TOF MS鑒定出所有的暗色真菌僅花費(fèi)了3～7 d。這說明隨著數(shù)據(jù)庫的完善，MALDI-TOF MS有望具有比分子鑒定更快速簡便更低成本的優(yōu)勢。

2 治療藥物的研究進(jìn)展

目前暗色真菌感染的治療以系統(tǒng)性抗真菌藥物為主，除了伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、兩性霉素B等常用藥物外，泊沙康唑(posaconazole)、拉夫康唑(ravuconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、盧立康唑(luliconazole)、拉諾康唑(lanoconazole)、艾氟康唑(efinaconazole)以及與常用抗真菌藥物具有協(xié)同作用的藥物的研究也取得了一定進(jìn)展，使得治療藥物的選擇更為多樣化。

2.1 新型唑類藥物

泊沙康唑 是伊曲康唑的衍生物，為廣譜三唑類抗真菌藥物，其親脂性與伏立康唑相近，后者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中可達(dá)到較高的濃度，有報(bào)道證實(shí)泊沙康唑可能也是目前治療中樞性暗色絲孢霉病的最佳三唑類藥物[9]。此外，泊沙康唑是唑類藥物中最有效的抗鏈格孢菌藥物[10-12]，其MIC值通常較低，組織分布良好，與伊曲康唑相比藥物相互作用較少，可作為治療皮膚鏈格孢菌感染的最佳選擇[13-15]。

拉夫康唑和艾沙康唑 也屬于三唑類的抗真菌藥物，均為氟康唑的衍生物。艾沙康唑的藥物分子與真菌甾醇合成過程中的關(guān)鍵酶——羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)具有相比于其他唑類藥物更強(qiáng)的親和力，因此其抗真菌譜還涵蓋了一些對其他三唑類藥物耐藥的少見菌[16]，例如阿薩希毛孢子菌、紅酵母屬、地絲菌屬、畢赤酵母屬等[17]。在Zheng等[18]的研究中，通過檢測3種棘白菌素類藥物(阿尼芬凈、米卡芬凈、卡泊芬凈)和8種非棘白菌素類藥物(拉夫康唑、艾沙康唑、氟胞嘧啶、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑和兩性霉素B)對84株暗色真菌的體外最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)對于大部分菌種，拉夫康唑和艾沙康唑具有優(yōu)于伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑及棘白菌素類藥物的抑菌效果。美國FDA已于2015年3月批準(zhǔn)艾沙康唑作為侵襲性曲霉病和毛霉病的主要治療藥物，拉夫康唑也作為治療甲真菌病的口服制劑于2018年在日本上市[19,20]，但這兩種藥物治療暗色真菌感染的臨床安全性和有效性尚未見報(bào)道。

盧立康唑、拉諾康唑和艾氟康唑 這三種藥物同樣通過抑制CYP51來干擾真菌細(xì)胞膜麥角甾醇的生物合成，已被批準(zhǔn)用于治療足癬和甲真菌病，其中艾氟康唑也為氟康唑的衍生物[21-23]。對暗色真菌的28株臨床分離株和102株環(huán)境分離株進(jìn)行體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)抗真菌藥物(伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、兩性霉素B和氟康唑)相比，盧立康唑的平均MIC值最低，其次是拉諾康唑和艾氟康唑。其MIC值幾何均數(shù)依次為：臨床分離株0.0008 μg/mL、0.0028 μg/mL、0.0966 μg/mL；環(huán)境分離株0.002 μg/mL、0.009 μg/mL、0.10 μg/mL。而傳統(tǒng)藥物中，對臨床分離株MIC值幾何均數(shù)最低的為伊曲康唑(0.2383 μg/mL)，對環(huán)境分離株MIC值幾何均數(shù)最低為伏立康唑(0.20 μg/mL)[24]。由此可見，新的三唑類藥物較傳統(tǒng)藥物體外抗菌活性更強(qiáng)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

2.2 與唑類藥物具有協(xié)同作用的藥物

Hsp90抑制劑 熱休克蛋白Hsp90是一種高度保守的分子伴侶，是真菌耐藥、應(yīng)激反應(yīng)、形態(tài)轉(zhuǎn)換以及毒力相關(guān)的細(xì)胞通路樞紐[25]。研究發(fā)現(xiàn)真菌通過應(yīng)激反應(yīng)來抵抗藥物對細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的損傷作用，而阻斷Hsp90在真菌應(yīng)激通路中的作用或可避免真菌耐藥并顯著增加抗真菌藥物的療效[26]。17-AAG(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin)是一種有效的Hsp90抑制劑，在Gao等[27]的研究中，通過對18株皮炎外瓶霉分離株進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)17-AAG可增強(qiáng)唑類藥物對皮炎外瓶霉的抗真菌活性。與單獨(dú)使用相比, 17-AAG與泊沙康唑、伊曲康唑和伏立康唑聯(lián)合使用分別對15株(83.3%)、12株(66.7%)和1株(5.6%)皮炎外瓶霉菌株有協(xié)同作用，這在治療皮炎外瓶霉感染方面可能具有極其重要的意義。但由于Hsp90的結(jié)構(gòu)在真核生物中高度保守，現(xiàn)有的Hsp90抑制劑缺乏真菌特異性且具有人體細(xì)胞毒性，限制了其在抗真菌治療中的應(yīng)用。需要更多的努力來開發(fā)真菌特異性的Hsp90抑制劑。

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種Ca2+-鈣調(diào)素依賴性蛋白磷酸酶，在真菌的各種生理過程及藥敏性和毒性中發(fā)揮著重要作用，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑已被證明能使唑類藥物具有殺菌作用[28,29]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[30]，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的靶向抑制藥物他克莫司，與伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑聯(lián)合使用時(shí)，分別對11株(68.8%)、14株(87.5%)和16株(100%)的皮炎外瓶霉菌株表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用。這提示鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑能使唑類藥物的抗暗色真菌活性增效。但需注意的是，他克莫司作為一種免疫抑制劑，有誘發(fā)真菌感染的可能性，且目前對這類藥物的研究僅局限于體外試驗(yàn)，故其用于臨床真菌感染的可行性尚有待驗(yàn)證。

3 結(jié) 語

由于暗色真菌的種類繁多，不同種類的菌株對抗真菌藥物的敏感性不同，目前尚缺乏大樣本的暗色真菌感染的臨床試驗(yàn)資料，其治療數(shù)據(jù)多來源于零散的病例報(bào)告。隨著對此類感染的日益重視，診斷方法的不斷改良，療效更佳的新藥物的不斷研發(fā)，以及臨床研究的日益深入，對暗色真菌的感染將有望實(shí)現(xiàn)高敏感、高特異性的早期診斷及針對性更強(qiáng)的個(gè)體化治療。