高產(chǎn)木糖醇菌株的誘變選育及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

陳雪松 楊勝利

1 浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院 （浙江杭州 310015）

2 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 （浙江杭州 310014）

木糖醇是一種天然甜味劑，化學(xué)名為“戊五糖”，是一種五碳糖。木糖醇外觀和味覺與蔗糖相似，具有清涼甜味。和其他糖醇相比，木糖醇是多元醇中最甜的甜味劑[1]，目前已被廣泛應(yīng)用于食品、印染、紡織、醫(yī)藥、國防、化工及皮革等領(lǐng)域[2]。

木糖醇的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法主要以玉米芯和甘蔗渣為原料，利用酸水解預(yù)處理，經(jīng)多次精制獲得木糖，再加氫生產(chǎn)木糖醇，存在污染重、資源消耗大、產(chǎn)量低、成本高等缺點(diǎn)[3-4]。采用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)木糖醇，可省去多次提純、精制步驟，同時實(shí)現(xiàn)綠色生產(chǎn)[5]。

生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)木糖醇以反應(yīng)條件溫和、資源消耗少和對環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)，但存在木糖醇生產(chǎn)率低、菌株生產(chǎn)能力低的缺點(diǎn)[6]。為提高生物轉(zhuǎn)化法的木糖醇轉(zhuǎn)化率，本研究通過對前期自然篩選得到的菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，探討其木糖醇轉(zhuǎn)化率，同時對發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源和無機(jī)鹽進(jìn)行了優(yōu)化，以期為后期工業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

木糖醇轉(zhuǎn)化菌，Y-3 號（木糖醇轉(zhuǎn)化率36.5%），浙江工業(yè)大學(xué)生物制藥研究所篩選并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：D-木糖20 g、酵母膏5 g、磷酸二氫鉀2 g、二水氯化鈣0.1 g、七水硫酸鎂0.2 g、硫酸銨5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH=6.0，于121℃濕熱滅菌20 min。

菌種保藏培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、酵母膏5 g、磷酸二氫鉀2 g、二水氯化鈣0.1 g、七水硫酸鎂0.2 g、硫酸銨5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH=6.0，于121 ℃濕熱滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：竹筍殼水解液（含木糖20 g）、蛋白胨10 g、酵母粉10 g、蒸餾水1 000 mL，pH=6.0，于121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.1.3 試劑

實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司、杭州邦易化工有限公司。

DNS 試劑：750 mL 去離子水微熱后依次加入10.00 g 3,5-二硝基水楊酸、16.00 g 氫氧化鈉、5.00 g苯酚、5.00 g 亞硫酸鈉和300.00 g 酒石酸鉀鈉，溶解后移入棕色容量瓶，定容至1 000 mL，于室溫下暗處放置一周后使用。

試劑a：將0.320 g 高碘酸鉀溶于100 mL 1%的鹽酸中。

試劑b：鼠李糖1.11 g/L。

NaSH 試劑（現(xiàn)配現(xiàn)用）：100 mL 150 g/L 的乙酸銨溶液中，分別加入0.2 mL 乙酸及乙酰丙酮，搖勻。

1.1.4 主要儀器

D 型單人式凈化工作臺，上海恒勤儀器設(shè)備有限公司；TDL-5 低速臺式大容量離心機(jī)，南京東邁科技儀器有限公司；ZHWY-2102C 恒溫培養(yǎng)搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；752 紫外可見分光光度計，上海天翔光學(xué)儀器有限公司；LS-B50L 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；EYELA NVC-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會社。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

將Y-3 號菌株接入10 支斜面培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h；取菌落大而厚，濕潤，表面光滑，質(zhì)地均勻，正、反面及中央與邊緣顏色一致的5支，用生理鹽水洗下菌苔，3 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用生理鹽水洗滌兩次，轉(zhuǎn)入大試管制成菌懸液。

1.2.2 誘變處理

1.2.2.1 化學(xué)誘變

向大試管中依次加入0.2 mol/L 亞硝酸鈉溶液和菌懸液各1 mL 后，立即加入1 mL pH=4.5 的醋酸緩沖液，充分混合后，置于27 ℃水浴中誘變5 min，然后加0.07 mol/L pH=8.6 的磷酸氫二鈉溶液2 mL以終止反應(yīng)。將經(jīng)亞硝酸鈉處理后的菌懸液用無菌水稀釋104倍后，各取0.1 mL 均勻地涂布3 套平板，30 ℃避光培養(yǎng)48 h。

1.2.2.2 紫外誘變

將亞硝酸鈉誘變后木糖醇轉(zhuǎn)化率最高的菌株接入10 支斜面培養(yǎng)基，同方法1.2.1 制備菌懸液。取無菌平皿5 套，分別加入5 mL 菌懸液，開啟磁力攪拌器，15 W 紫外燈30 cm 處照射120 s。將經(jīng)紫外線照射的菌懸液稀釋104倍后，各取0.1 mL 均勻地涂布3 套平板，30 ℃培養(yǎng)48 h，計算木糖醇轉(zhuǎn)化率。

1.2.2.3 二輪復(fù)合誘變

取紫外誘變后木糖醇轉(zhuǎn)化率最高的菌株按上述方法再依次進(jìn)行化學(xué)誘變和紫外誘變。

1.2.3 菌落的篩選與發(fā)酵

從每套平板中挑選至少3 個長勢較好、形狀規(guī)則、直徑較大的單菌落接入100 mL 種子培養(yǎng)液中，30 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)24 h。按5%的接種量接入100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)48 h后靜置24 h。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源與無機(jī)鹽的優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)過二輪誘變后木糖醇轉(zhuǎn)化率最高的菌株接入斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上挑取適量接種到100 mL 種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)24 h。按5%接種量用無菌移液管將種子液接種到100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)。

分別用10 g/L（以氮計）的牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨和尿素作為氮源，每個變量各做3 個平行組，測定木糖醇轉(zhuǎn)化率。另分別用0.2 g/L 的硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣和0.5 g/L 的磷酸二氫鉀作為無機(jī)鹽，每個變量做3 個平行組，測定木糖醇轉(zhuǎn)化率。

1.2.4.2 四因素三水平正交試驗(yàn)

發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化：在氮源和無機(jī)鹽單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對氮源和無機(jī)鹽按表1 進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.5 發(fā)酵液木糖和木糖醇質(zhì)量濃度測定

取10 mL 經(jīng)搖勻的發(fā)酵液，3 500 r/min 離心10 min，取上清液適當(dāng)稀釋。在25 mL 試管中加入1 mL稀釋后的上清液和3 mL DNS 試劑，沸水浴5 min，冷卻定容至25 mL，測量540 nm 處吸光度，根據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算水解液中木糖質(zhì)量濃度。

取10 mL 經(jīng)搖勻的發(fā)酵液，3 500 r/min 離心10 min，取上清液適當(dāng)稀釋。取1 mL 稀釋液，與1 mL 試劑a 室溫反應(yīng)10 min，再加入2 mL 試劑b 和4 mL NaSH 試劑，混勻后于53 ℃水浴中保溫15 min，冷卻后測量412 nm 處吸光度，再根據(jù)木糖醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算發(fā)酵液中木糖醇的質(zhì)量濃度。

1.2.6 木糖醇轉(zhuǎn)化率的計算

初始培養(yǎng)基的木糖質(zhì)量濃度均為20 mg/mL。木糖醇轉(zhuǎn)化率按公式（1）計算。

式中：ρ1為發(fā)酵液中木糖醇質(zhì)量濃度，mg/mL；ρ2為發(fā)酵液中殘留木糖質(zhì)量濃度，mg/mL；M1為木糖醇摩爾質(zhì)量，g/mol；M2為木糖摩爾質(zhì)量，g/mol。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)木糖醇菌株復(fù)合誘變及突變株篩選

將每次誘變結(jié)束后的誘變菌各做3 組平行試驗(yàn)，得到其木糖醇轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如表2 所示。對原菌Y-3 號進(jìn)行亞硝酸鈉和紫外復(fù)合誘變，得到一株木糖醇轉(zhuǎn)化率50.3%的Y-3-7 號菌株。

表2 第一輪復(fù)合誘變結(jié)果

以Y-3-7 號菌株作為出發(fā)菌株再次進(jìn)行亞硝酸鈉和紫外誘變，得到一株木糖醇轉(zhuǎn)化率54.5%的菌株Y-3-7-4，其比原出發(fā)菌株的木糖醇轉(zhuǎn)化率提升了49.3%，結(jié)果如表3 所示。同時也有一些菌株在誘變后轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)了下降，這可能與致死率有關(guān)[7]；可以通過控制致死率來提高正向突變的概率。

2.2 高產(chǎn)木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的選擇優(yōu)化

氮源對微生物的生長發(fā)育和代謝產(chǎn)物的生成非常重要作用。不同種類氮源可能影響代謝產(chǎn)物合成的量。牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素等都是常用氮源。分別以該4 種氮源為單一氮源，以Y-3-7-4 菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行氮源優(yōu)化，結(jié)果如圖1 所示。從圖1 可知，在其他條件相同時，選用蛋白胨、牛肉膏時木糖醇轉(zhuǎn)化率較高。說明酵母以有機(jī)氮源為氮源時更有利于轉(zhuǎn)化木糖，可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮源中含有多種生長因子。其中：蛋白胨效果最好，木糖醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)56.04%；無機(jī)氮源硫酸銨的效果較差，木糖醇轉(zhuǎn)化率為46.36%；尿素作氮源時，木糖醇轉(zhuǎn)化率為45.66%。

表3 第二輪復(fù)合誘變結(jié)果

圖1 不同氮源的木糖醇轉(zhuǎn)化率

2.3 高產(chǎn)木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)鹽的選擇優(yōu)化

無機(jī)鹽是微生物生長代謝過程中酶活性中心的組成部分，不同的無機(jī)鹽可能會影響酶的活性，從而影響菌株的代謝途徑和木糖醇的積累。以Y-3-7-4菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行無機(jī)鹽優(yōu)化，選用4 種無機(jī)鹽，木糖醇轉(zhuǎn)化率如圖2 所示。由圖2 可知，在其他條件相同時，選用0.2 g/L 的硫酸鎂和0.5 g/L 的磷酸二氫鉀，木糖醇轉(zhuǎn)化率較高。硫、鎂、磷、鉀都是酵母發(fā)酵過程中必需的微量元素，可以激活酶促反應(yīng)或參與生物合成反應(yīng)。尤其是Mg2+，它是酵母生長必需的，以酶的激活劑發(fā)揮作用，在磷酸轉(zhuǎn)移酶類和許多脫羧酶的激活中發(fā)揮重要作用；而H2PO4-有利于酵母細(xì)胞的代謝進(jìn)入磷酸戊糖途徑。因此硫酸鎂和磷酸二氫鉀是酵母木糖轉(zhuǎn)化的較好的無機(jī)鹽。

2.4 高產(chǎn)木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)氮源和無機(jī)鹽優(yōu)化結(jié)果，選擇牛肉膏、蛋白胨作為氮源，硫酸鎂、磷酸二氫鉀作為無機(jī)鹽，對牛肉膏、蛋白胨、硫酸鎂及磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，通過測定木糖醇最高轉(zhuǎn)化率來確定最佳培養(yǎng)基配方。結(jié)果如表4 所示。

圖2 不同無機(jī)鹽的木糖醇轉(zhuǎn)化率

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果表

從表4 可以看出，不同發(fā)酵培養(yǎng)基組合對木糖醇轉(zhuǎn)化率都有影響。其中牛肉膏極差最大，是影響木糖醇轉(zhuǎn)化率的最關(guān)鍵因子，其次是硫酸鎂和磷酸二氫鉀，蛋白胨影響最小。4，5，6，7 號試驗(yàn)中木糖醇轉(zhuǎn)化率較高，而其他組木糖醇轉(zhuǎn)化率不高，與原始培養(yǎng)基相比甚至出現(xiàn)了抑制木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的現(xiàn)象。根據(jù)各因素水平，A取A2，B取B3，C取C3，D取D2為好，即最佳培養(yǎng)基為A2B3C3D2。由于B的極差最小，對木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響最小，因此將其作為誤差項對A，C，D作方差分析。

2.5 方差分析

方差分析結(jié)果如表5 所示。

表5 方差分析結(jié)果

從表5 中F值的大小看出，各因素對木糖醇轉(zhuǎn)化率影響的大小順序?yàn)锳＞C＞D，即牛肉膏質(zhì)量濃度對木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響最為顯著。

3 結(jié)論

本研究以一株產(chǎn)木糖醇菌株為出發(fā)菌株，對其進(jìn)行紫外和化學(xué)復(fù)合誘變，經(jīng)過兩輪復(fù)合誘變得到一株高產(chǎn)木糖醇菌株，木糖醇轉(zhuǎn)化率為54.5%，比出發(fā)菌株提高了49.3%。

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了蛋白胨和牛肉膏為最佳氮源，硫酸鎂和磷酸二氫鉀為最佳無機(jī)鹽；通過4 種因素的正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)牛肉膏對木糖醇轉(zhuǎn)化率影響最大，硫酸鎂、磷酸二氫鉀的影響依次變小，蛋白胨的影響最小。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：牛肉膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L。菌株木糖醇轉(zhuǎn)化率提高到63.0%，比出發(fā)菌株提高了72.6%，為后續(xù)通過產(chǎn)木糖醇菌株生產(chǎn)木糖醇技術(shù)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。