桑葉多糖的分離純化及其抑菌活性研究

孫偉，葉潤(rùn)，蔡靜，王銳麗

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000）

桑葉，又名神仙葉、鐵扇子，是桑科落葉喬木桑（Morus alba L.）的干燥葉子，在我國(guó)分布廣泛。《中國(guó)藥典》記載桑葉具有疏風(fēng)散熱、潤(rùn)肺清燥、清肝明目等功效，主要用來(lái)預(yù)防和祛除風(fēng)熱感冒、燥咳肺熱、頭痛頭暈和目赤昏花等病癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)，桑葉具有獨(dú)特的藥用價(jià)值，如抗病毒、抗衰老、抗疲勞、抗血栓、降血壓、抗腫瘤以及降血糖血脂等作用[2-4]。多糖作為桑葉的主要成分之一，具有抗凝血、抗氧化、降血糖等多種作用[5-6]，近年來(lái)對(duì)桑葉多糖的研究比較多，主要集中在桑葉多糖提取工藝的優(yōu)化[7]、不同品種桑葉中多糖含量的比較[8]、不同時(shí)間段采摘的桑葉中多糖含量的比較[9]以及桑葉多糖提取分級(jí)及其抗輻射氧化脅迫作用[10]等，對(duì)桑葉多糖的純化研究較少。

大孔樹(shù)脂是一種穩(wěn)定的極性、非極性或微親水性聚合物，具有較高的吸附容量，較好選擇性，可回收的吸附高分子聚合物，且成本相對(duì)較低，易于再生。目前，它們多用于植物中多糖、多酚、黃酮或者色素等的分離純化[11-14]，但尚未見(jiàn)桑葉多糖提取后利用大孔樹(shù)脂純化研究及抑菌活性評(píng)價(jià)的報(bào)道。

本文將桑葉多糖經(jīng)超聲-微波協(xié)同提取后，用AB-8、X-5、LS-8、HPD-100、DA-201、NKA-9、ADS-17、HP20這8種不同類(lèi)型的大孔樹(shù)脂，通過(guò)對(duì)桑葉多糖的比吸附量、吸附率及解吸率的測(cè)定，為桑葉多糖的制備與分離提供一種有效的方法，同時(shí)對(duì)桑葉多糖純化前后的抑菌作用進(jìn)行研究，為桑樹(shù)及桑葉資源的深度開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉：2018年11月采摘于信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，經(jīng)信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院中藥教研室梁麗香副教授鑒定為桑（Morus alba L.）的成熟葉片；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；蒽酮：上海展云化工有限公司；大孔樹(shù)脂：山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司；濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇（分析純）：武漢市中天化工有限責(zé)任公司；瓊脂粉（分析純）：北京亞米生物科技有限公司；大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌：信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；所有試驗(yàn)用水均為二次重蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；ME104型電子分析天平：瑞士梅特勒公司；HG101-3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：南京卓鼎干燥設(shè)備廠(chǎng)；400Y型多功能粉碎機(jī)：永康市鉑歐五金制品有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；DKZ-2B型電熱恒溫振蕩水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RWBC-08S型微波萃取反應(yīng)儀：南京蘇恩瑞實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JM-23D-40型超聲波清洗器：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；SPX-70BE生化培養(yǎng)箱、XFS-280A型高壓滅菌鍋：上海力辰儀器科技有限公司；層析柱[20 mm（15 mm）×200 mm]：江陰市新輝層析設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桑葉多糖的粗提

將干燥桑葉粉碎，過(guò)60目篩，取20 g置于500 mL燒杯中，加入400 mL蒸餾水，將混合液于80℃熱水中浸提3 h后置超聲波清洗器中，超聲功率80 W，超聲時(shí)間20 min，超聲結(jié)束后進(jìn)行微波萃取，微波功率140 W，微波時(shí)間3 min，冷卻至室溫（25℃）后過(guò)濾得提取液[15]。然后將提取液旋轉(zhuǎn)濃縮，緩慢加入無(wú)水乙醇使最后乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，攪拌混勻后4℃下靜置40 min，離心10 min，收集沉淀物，干燥備用。

1.3.2 多糖含量測(cè)定

以葡萄糖為對(duì)照品，用常規(guī)的多糖含量測(cè)定方法：蒽酮-硫酸法[16]，得線(xiàn)性回歸方程 y=0.085 3x＋0.049 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。

1.3.3 大孔樹(shù)脂的處理

將本試驗(yàn)選用的8種大孔樹(shù)脂，先用重蒸水沖洗，接著以3倍柱體積的無(wú)水乙醇密封浸泡24 h，再用重蒸水反復(fù)沖洗至樹(shù)脂無(wú)乙醇味；然后再分別先后用3倍柱體積質(zhì)量濃度6%的NaOH溶液和6%的HCl溶液浸泡3 h，用大量重蒸水沖洗至中性，室溫（25℃）瀝干，備用[17]。

1.3.4 大孔樹(shù)脂的篩選

以8種不同類(lèi)型的大孔樹(shù)脂AB-8、X-5、D-101、DM301、DA-201、NKA-9、LX-17 及 HP20 對(duì)桑葉多糖的比吸附量、吸附率及解吸率為考察指標(biāo)進(jìn)行綜合對(duì)比，優(yōu)選適宜純化桑葉多糖的大孔樹(shù)脂。

1.3.4.1 大孔樹(shù)脂吸附試驗(yàn)

分別稱(chēng)取2.0 g處理過(guò)的8種不同類(lèi)型的大孔樹(shù)脂，放入250 mL具塞錐形瓶中，再加入40 mL質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL桑葉多糖溶液，將錐形瓶置于25℃恒溫?fù)u床上以100 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩12 h，吸取上清液，根據(jù)“1.3.2”項(xiàng)中方法測(cè)定波長(zhǎng)在625 nm下吸光度，并計(jì)算多糖的含量，計(jì)算比吸附量（Q）及吸附率（E），每組試驗(yàn)平行做3次，取其平均值。

Q/（mg/g）=（C0-C1）V/m

E/%＝[（C0-C1）/C0]×100

式中：C0、C1為吸附前、后溶液中桑葉多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品溶液的體積，mL；m為大孔樹(shù)脂的質(zhì)量，g。

1.3.4.2 大孔樹(shù)脂解吸附試驗(yàn)

將充分吸附12 h后的8種不同類(lèi)型的大孔樹(shù)脂過(guò)濾并用重蒸水沖洗后置于250 mL的具塞錐形瓶中，再分別加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液，同樣將錐形瓶置于25℃恒溫?fù)u床上以100 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩12 h進(jìn)行充分解吸附，根據(jù)“1.3.2”項(xiàng)中方法測(cè)定波長(zhǎng)在625 nm下吸光度，并計(jì)算多糖的含量，計(jì)算解吸率（D），每組試驗(yàn)平行做3次，取其平均值。

D/%=[C2/（C0-C1）]×100

式中：C0、C1為吸附前、后溶液中桑葉多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為解吸液中桑葉多糖的含量，mg/mL。

1.3.4.3 AB-8樹(shù)脂吸附與解吸動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

按照“1.3.4.1”項(xiàng)中大孔樹(shù)脂吸附試驗(yàn)中方法對(duì)AB-8型大孔樹(shù)脂進(jìn)行桑葉多糖的靜態(tài)吸附，每隔0.5h，取樣1 mL，測(cè)定桑葉多糖的質(zhì)量濃度，計(jì)算其吸附率，繪制大孔樹(shù)脂吸附時(shí)間與吸附率的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。

按照“1.3.4.2”項(xiàng)中大孔樹(shù)脂解吸試驗(yàn)中方法處理已吸附完成的AB-8型大孔樹(shù)脂，進(jìn)行解吸，同樣每隔0.5 h，取樣1 mL，測(cè)定桑葉多糖的質(zhì)量濃度，計(jì)算對(duì)應(yīng)時(shí)間的解吸率，繪制AB-8型大孔樹(shù)脂的動(dòng)力學(xué)解吸曲線(xiàn)。

1.3.5 AB-8型大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸條件考察

1.3.5.1 粗多糖上樣液pH值和解吸液pH值

按照“1.3.4.1”項(xiàng)中方法配制粗多糖溶液，攪拌充分后用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)上樣液酸度，使pH值分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，再將錐形瓶置于 25 ℃恒溫?fù)u床上以100r/min的轉(zhuǎn)速吸附6h，取上清液，測(cè)定多糖含量，計(jì)算大孔樹(shù)脂的吸附率與上樣液pH值的關(guān)系。

按照“1.3.4.2”項(xiàng)中方法把已經(jīng)吸附完成的樹(shù)脂，在 pH 值分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的環(huán)境中解吸4 h，取上清液，測(cè)定多糖含量，計(jì)算大孔樹(shù)脂的解吸率與解吸液pH值的關(guān)系。

1.3.5.2 上樣液質(zhì)量濃度

將1.3.1中制備的桑葉粗多糖配制成質(zhì)量濃度為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/mL 溶液各 40 mL 于 250 mL具塞錐形瓶中，各加入2.0 g處理過(guò)的AB-8型大孔樹(shù)脂后密封，置錐形瓶于25℃恒溫?fù)u床上以100 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩吸附6 h，取上清液，測(cè)定多糖含量，計(jì)算大孔樹(shù)脂的解吸率與上樣液質(zhì)量濃度的關(guān)系。

1.3.5.3 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)

稱(chēng)取15.0 g處理過(guò)的AB-8型大孔樹(shù)脂，放入500mL具塞錐形瓶中，再加入300 mL質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL桑葉粗多糖溶液，將錐形瓶置于25℃恒溫?fù)u床上以100 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩6 h，過(guò)濾并用重蒸水沖去表面未吸附的多糖及其它雜質(zhì)，瀝干水分，從中稱(chēng)取6份均為2.0 g置于250 mL具塞錐形瓶中，依次加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇水溶液在同樣的解吸條件下振蕩解吸4h，按照“1.3.4.2”項(xiàng)中方法計(jì)算大孔樹(shù)脂的解吸率與解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系。

1.3.6 AB-8型大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸附條件優(yōu)化

1.3.6.1 上樣流速

稱(chēng)取10.0 g處理過(guò)的AB-8型大孔樹(shù)脂按濕法裝柱裝入Ф20 mm（15 mm）×200 mm的層析柱中，加入pH值為3.0，質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL相同體積的桑葉粗多糖溶液。分別以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 BV/h 的流速上樣。分段收集流出液，測(cè)定吸光度，計(jì)算大孔樹(shù)脂的吸附率與上樣流速的關(guān)系。

1.3.6.2 洗脫流速

根據(jù)1.3.6.1得到的最佳流速上樣振蕩吸附，吸附完成后用體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇，分別以流速為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 BV/h 進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫，分段收集流出液，測(cè)定吸光度，計(jì)算大孔樹(shù)脂的解吸率與洗脫流速的關(guān)系。

1.3.6.3 動(dòng)態(tài)洗脫曲線(xiàn)

按照以上試驗(yàn)確定的最佳純化工藝條件：取Ф20mm（15 mm）×200 mm的玻璃色譜柱，裝入10.0 g處理過(guò)的AB-8型樹(shù)脂，以pH 3.0，質(zhì)量濃度3.0 mg/mL的桑葉粗多糖溶液為上樣液，并控制其上樣流速為1.5 BV/h，進(jìn)行吸附；吸附完成后先以2.0 BV的重蒸水沖洗樹(shù)脂表面尚未被吸附粗多糖溶液，再以pH 6.0，體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，同時(shí)控制洗脫流速為1.5 BV/h，分段收集流出液，測(cè)定吸光度，計(jì)算各段流出液中的多糖濃度，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線(xiàn)。

1.3.7 多糖的抑菌試驗(yàn)

按牛津杯法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定[18]，以大腸桿菌、沙門(mén)氏菌及金黃色葡萄球菌為受試菌，分別考察桑葉多糖粗提樣、桑葉多糖純化樣、陽(yáng)性對(duì)照青霉素溶液、陰性對(duì)照無(wú)菌水的抑菌活性。移取100 μL菌液（濃度為107cfu/mL）均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)基平板上，淺淺插入已滅菌牛津杯，并將200 μL不同濃度的藥液加入牛津杯中，再將所有各樣液平板放入培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)18 h后，測(cè)量抑菌圈直徑大小，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)平行做3次，所得數(shù)據(jù)取平均值，單因素試驗(yàn)采用Excel 2007軟件和SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的篩選

8種不同類(lèi)型的大孔樹(shù)脂對(duì)桑葉多糖的吸附與解吸效果如表1所示。

表1 8種不同類(lèi)型的大孔樹(shù)脂的吸附與解吸效果分析Table 1 Adsorption and desorption effects of 8 different types of macroporous resins

適宜的純化樹(shù)脂對(duì)桑葉多糖不僅有好的比吸附量和吸附率，還要有較好的解吸率。大孔樹(shù)脂NKA-9比吸附量最大，但其解吸率最低；HPD-100和AB-8樹(shù)脂吸附效果相差不大，均有85%以上的吸附率，HPD-100樹(shù)脂的比吸附量和吸附率比AB-8高均不到3%，而AB-8樹(shù)脂的解吸率比HPD-100高約33%，可以使其吸附的桑葉多糖很好地被洗脫。因此，AB-8樹(shù)脂是桑葉多糖的吸附與解吸試驗(yàn)適宜的樹(shù)脂。

2.2 AB-8樹(shù)脂吸附與解吸動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)桑葉粗多糖的靜態(tài)吸附與解吸附曲線(xiàn)如圖1所示。

圖1 AB-8型樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)Fig.1 Static adsorption and desorption kinetics curves of AB-8 resin

在0～2.5 h區(qū)間內(nèi)AB-8型樹(shù)脂對(duì)桑葉多糖的吸附率呈勻速上升趨勢(shì)，在2.5 h達(dá)到吸附的最大值。繼續(xù)延長(zhǎng)吸附時(shí)間，吸附率有起伏，但基本趨于穩(wěn)定。通過(guò)解吸曲線(xiàn)可看出，在0～3 h內(nèi)，AB-8型樹(shù)脂對(duì)桑葉多糖的解吸率上升較快，在4 h解吸率達(dá)到最大值76.64%。但在之后解吸率隨時(shí)間逐漸降低，應(yīng)該是洗脫液逐漸飽和所引起的。

2.3 AB-8樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸附影響條件分析

2.3.1 上樣液pH值和解吸液pH值

pH值對(duì)吸附和解吸效果的影響見(jiàn)圖2所示。

圖2 pH值對(duì)吸附和解吸效果的影響Fig.2 Effect of pH on adsorption and desorption

如圖2所示，上樣液pH值為4.0時(shí)AB-8型樹(shù)脂對(duì)桑葉多糖的吸附率最高，為90.06%，當(dāng)上樣液pH值低于3.0或高于5.0時(shí)，多糖在相對(duì)偏酸或偏堿的溶液中溶解度較差，不利于樹(shù)脂的吸附，因此最佳上樣液pH值為4.0。在解吸液pH值為6.0時(shí)AB-8型樹(shù)脂對(duì)桑葉多糖的解吸率最高，為78.11%；在pH值小于6.0時(shí)，解吸率隨酸性增加而降低；而在pH值大于6.0的中性和弱堿性環(huán)境中，解吸率呈降低趨勢(shì)，所以最佳解吸液pH值為6.0。這可能因?yàn)樯Ｈ~中多糖類(lèi)物質(zhì)多數(shù)顯弱酸性[19]，在pH 3.0～5.0的溶液中呈穩(wěn)定的分子狀態(tài)被吸附，而在pH值為6.0的環(huán)境多呈游離態(tài)，不利于吸附而被洗脫下來(lái)。

2.3.2 上樣液質(zhì)量濃度

上樣液濃度對(duì)吸附效果的影響見(jiàn)圖3所示。

圖3 上樣液濃度對(duì)吸附效果的影響Fig.3 Effect of concentration of sample solution on adsorption effect

如圖3所示，上樣液濃度小于3.0 mg/mL時(shí)，隨著上樣液濃度的增大，AB-8型樹(shù)脂的吸附率逐漸增大。上樣液濃度為3.0 mg/mL時(shí)，AB-8型樹(shù)脂的吸附率最高，上樣液濃度大于3.0 mg/mL時(shí)，AB-8型樹(shù)脂的吸附率卻逐漸降低，形成這種現(xiàn)象原因可能是隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，溶液的黏度也在增大，直接影響樹(shù)脂孔道內(nèi)多糖分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，引起樹(shù)脂對(duì)桑葉粗多糖的吸附率下降[20]。而且，上樣液濃度過(guò)高，雜質(zhì)也會(huì)與多糖分子同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)吸附，甚至?xí)a(chǎn)生沉淀堵塞樹(shù)脂孔道，阻礙大孔樹(shù)脂對(duì)多糖分子的吸附[21]。所以，桑葉多糖適宜的上樣液濃度為3.0 mg/mL。

2.3.3 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)

解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響見(jiàn)圖4所示。

圖4 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響Fig.4 Effect of desorption concentration on desorption effect

由圖4可知，解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)在25%～65%之間，AB-8型樹(shù)脂對(duì)桑葉多糖的解吸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高；但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從65%遞增到95%時(shí)，解吸率卻呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楫?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)偏大時(shí)，會(huì)引起解吸液中一些大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等的溶解度減小而使沉淀析出，進(jìn)而阻礙樹(shù)脂中多糖分子的擴(kuò)散[22]，所以，應(yīng)以體積分?jǐn)?shù)為65%乙醇水溶液作為桑葉多糖適宜的解吸液。

2.4 AB-8型大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸條件分析

2.4.1 上樣流速

上樣流速對(duì)吸附效果的影響見(jiàn)圖5所示。

圖5 上樣流速對(duì)吸附效果的影響Fig.5 Effect of loading velocity on adsorption effect

由圖5可知，桑葉粗多糖溶液的上樣流速為1.0 BV/h時(shí)，AB-8型樹(shù)脂對(duì)桑葉多糖的吸附率最大，隨著上樣流速增大吸附率卻在逐漸下降，而當(dāng)流速為1.5 BV/h時(shí)吸附率僅比1.0 BV/h時(shí)低2.24%，但可以縮短試驗(yàn)時(shí)間和生產(chǎn)周期。所以，綜合考慮吸附效果和工作效率，選擇1.5 BV/h為最佳上樣流速。

2.4.2 洗脫流速

洗脫流速對(duì)解吸效果的影響見(jiàn)圖6所示。

圖6 洗脫流速對(duì)解吸效果的影響Fig.6 Effect of elution velocity on desorption effect

由圖6可知，洗脫流速對(duì)桑葉多糖解吸率影響顯著，流速為1.5 BV/h時(shí)解吸率最大，解吸率為78.42%，繼續(xù)增大洗脫流速，解吸率減小。較慢的洗脫速度使洗脫液與樹(shù)脂接觸較充分，有利于多糖的解吸，若流速過(guò)慢，解吸出的多糖分子可能重新被吸附，影響解吸效果；若流速過(guò)快，會(huì)造成洗脫液與樹(shù)脂接觸不充分，不能將多糖全部置換出來(lái)，就快速流出，同時(shí)也會(huì)影響解吸效果[23]。因此洗脫流速選1.5 BV/h為佳，且在吸附結(jié)束變換為解吸時(shí)不用轉(zhuǎn)動(dòng)旋塞。

2.4.3 動(dòng)態(tài)洗脫曲線(xiàn)

多糖的動(dòng)態(tài)洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖7所示。

圖7 多糖的動(dòng)態(tài)洗脫曲線(xiàn)Fig.7 Dynamic elution curve of polysaccharides

由圖7可知，動(dòng)態(tài)洗脫時(shí)，吸附飽和的AB-8型大孔樹(shù)脂上吸附的桑葉多糖比較容易被洗脫出來(lái)，5 mL洗脫液就可洗脫出桑葉多糖，當(dāng)流出液體積在35 mL左右時(shí)，流出液中桑葉多糖濃度最大。當(dāng)流出液體積為60 mL時(shí)，多糖含量不到0.1 mg/mL；當(dāng)流出液體積為90 mL（3.0 BV）時(shí)，流出液中桑葉多糖的含量已經(jīng)很少，不到0.02 mg/mL，桑葉多糖基本被洗脫完全。該曲線(xiàn)說(shuō)明，動(dòng)態(tài)條件下AB-8型大孔樹(shù)脂吸附的桑葉多糖解吸效果好，且洗脫劑用量少。

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證最佳工藝的試驗(yàn)效果，根據(jù)已優(yōu)選的最佳純化參數(shù)：上樣液濃度為3.0 mg/mL，pH 4.0，流速為1.5 BV/h；解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，pH 6.0，流速為1.5 BV/h，洗脫體積為90 mL（3.0 BV），對(duì)桑葉多糖進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與解吸，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，洗脫液進(jìn)行濃縮并低溫干燥，即得精品桑葉多糖。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算得桑葉多糖的回收率和純度，結(jié)果桑葉多糖回收率為87.14%（RSD=1.96%），純度為 57.46%（RSD=2.11%），而1.3.1中桑葉粗多糖純度為11.34%，提高了4.07倍。表明在上述工藝條件下AB-8型樹(shù)脂對(duì)桑葉多糖的富集純化穩(wěn)定，且多糖的回收率和純度均較高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2.6 抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果

桑葉多糖純化前后的抑菌效果見(jiàn)表2所示。

由表2可知，濃度大于1.0 mg/mL桑葉多糖對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的活性都存在不同程度的抑制作用，且純化后抑菌作用顯著增強(qiáng)。其中，純化后的桑葉多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑與青霉素相差不大，且對(duì)大腸桿菌的抑菌作用也強(qiáng)于青霉素，但對(duì)沙門(mén)氏菌抑制效果相對(duì)較差。

表2 桑葉多糖純化前后的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of polysaccharides in mulberry leaves before and after purification

3 結(jié)論

1）在所選的8種極性不同的大孔樹(shù)脂中，AB-8型樹(shù)脂對(duì)桑葉多糖的比吸附量、吸附率和解吸率均較高，且為快速平衡型樹(shù)脂，適宜分離純化桑葉多糖。

2）AB-8型樹(shù)脂桑葉多糖的最佳工藝參數(shù)：上樣液濃度為3.0 mg/mL，pH 4.0，流速為1.5 BV/h；解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，pH 6.0，流速為1.5 BV/h，洗脫劑體積為90 mL（3.0 BV）。此工藝可將桑葉多糖粗品的純度由11.34%提高到57.46%，提高了4.07倍，為桑葉多糖的分離純化提供了一種新方法。

3）用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明：濃度大于1.0 mg/mL桑葉多糖對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌及金黃色葡萄球菌的活性均存在不同程度的抑制作用，且純化后抑菌作用顯著增強(qiáng)。