黑靈芝多糖緩解運動性疲勞的效果

（天津師范大學體育科學學院，天津 300387）

靈芝（Ganoderma lucidum Karst.）是我國重要的藥食同源真菌資源，屬擔子菌綱多孔菌科，已有數(shù)千年藥用歷史，具有補氣安神、強身健體等很高的藥用價值[1-3]。靈芝中主要的活性成分是靈芝多糖，具有抗氧化、增強免疫力、調節(jié)血糖血脂、抗衰老和抗腫瘤等功效[4-5]。黑靈芝（Ganoderma atrum）被譽為靈芝中的極品，對人體健康具有良好的藥用療效，長期食用可調理多種機能[6]。

運動性疲勞是運動訓練中常見的生理現(xiàn)象，是機體出現(xiàn)的氧化應激反應，如不能及時消除疲勞可引起精神倦怠、運動能力下降、免疫力下降等病理現(xiàn)象[7]。通過補充合理的營養(yǎng)補劑或藥物緩解疲勞的產生，是消除運動性疲勞的有效措施[8]。鑒于黑靈芝多糖對人體具有多種調理機能，本研究從黑靈芝中分離純化黑靈芝多糖（Ganoderma atrum polysaccharides，GAP），研究其抗氧化能力，改善過度運動誘導的氧化應激，緩解運動性疲勞的產生。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康雄性昆明小鼠50只，5周齡，體重20 g～22 g，SPF 級[許可證號：SCXK（京）2019—0002]：北京華阜康生物科技股份有限公司；黑靈芝：江西贛州贛南靈芝基地；紅景天西洋參膠囊：廣州賽健生物科技有限公司。

血乳酸（blood urea nitrogen，BLA）試劑盒、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒、蒽酮試劑、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、Na+K+-腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）酶及 Ca2+Mg2+-ATP 酶試劑盒：南京建成生物工程研究所。血清葡萄糖（glucose，GLU）試劑盒：中生北控生物科技。

1.2 儀器與設備

JD-XSC型小鼠恒溫游泳池：上海繼德教學實驗器械廠；TGL-20B高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；LH750血液分析儀：美國貝克曼庫爾特有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；BT-3000 Plus全自動生化分析儀：意大利Biotecnica公司；XO-SM100超聲微波組合反應裝置：南京先歐儀器制造有限公司；FA1204T分析天平：廈門雄發(fā)儀器儀表有限公司；FSH-2型勻漿機：江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠；ALPHA1-2真空冷凍干燥機：德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 黑靈芝多糖（GAP）的制備

黑靈芝子實體粉碎至200目，用體積分數(shù)95%乙醇浸泡24 h脫脂，加入100℃純凈水浸提2 h，過濾，將浸提液旋蒸濃縮至原體積1/5，加入乙醇置于4℃的冰箱中2 h沉淀多糖，3 000 r/min離心30 min，采用Sevag法脫蛋白，然后依次用自來水透析48 h、蒸餾水透析24 h、超純水透析24 h，用體積分數(shù)95%乙醇沉淀，沉淀物依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌2次，濃縮，冷凍干燥，得到精制黑靈芝多糖；通過高效液相色譜法檢測，純度＞99.8%，通過高效液相色譜法、紅外光譜法、氣相色譜法、分子大小排阻色譜法及氨基酸分析儀測得多糖主要為甘露糖、半乳糖和葡萄糖，其質量比為 1∶1.28∶4.91，平均分子量為1 013 kDa[9]。

1.3.2 動物分組與灌胃

飼養(yǎng)室溫度（22±2）℃，相對濕度（50±5）%，自然光照，分籠飼養(yǎng)，自由飲水及攝食。小鼠普通飼料飼養(yǎng)一周，隨機分為5個實驗組，分別為黑靈芝多糖低劑量組（GAPL組）、中劑量組（GAPM 組）、高劑量組（GAPH組）、空白組（BC組）、陽性對照組（AG組），每組10只小鼠，共50只。

將黑靈芝多糖制備成濃度分別為2.5、5、10 mg/mL的水溶液，每日灌胃10 mL/（kg·d），即低、中、高劑量組每天分別灌胃25、50、100 mg/（kg·d）黑靈芝多糖；空白組每日灌胃一次蒸餾水10 mL/（kg·d）；陽性對照組按說明書推薦用量每日灌胃紅景天西洋參溶液200 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃 30 d。

1.3.3 小鼠體重測定

試驗第0、10、20、30天早上8點稱量小鼠體重并記錄。

1.3.4 負重游泳實驗

小鼠末次灌胃30 min后，將鼠尾根部系上其體質量5%的鉛條，將小鼠置于游泳箱（50 cm×50 cm×40 cm）中游泳，水深30 cm，水溫（25±1.0）℃。記錄小鼠自游泳開始至鼻孔10 s不能浮出水面的時間，即小鼠游泳力竭時間[10]。

1.3.5 血清疲勞相關指標檢測

小鼠末次灌胃30 min后游泳至力竭，取出擦凈水，眼球取血，在4℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液血清于EP管中，-20℃保存?zhèn)溆?；檢測血清乳酸（BLA）、血清葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA），嚴格按照試劑盒說明書進行操作[11]。

1.3.6 肝糖原和肌糖原檢測

小鼠末次灌胃30 min后游泳至力竭，取出擦凈水，取血后脫頸處死小鼠取其肝臟和后腿肌肉，用生理鹽水漂洗3遍，用濾紙擦干并稱重，取0.5 g標本，按1∶9（質量比）加入生理鹽水，并置于冷凍研磨機中進行粉碎勻漿化，勻漿后3 000 r/min離心15 min，取上清液于EP管中，-20℃保存?zhèn)溆?，以分光光度法利用蒽酮試劑測定肝糖原和肌糖原含量[12]。

1.3.7 肝組織抗氧化指標檢測

按照1.3.6的方法制備肝組織液，檢測超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、Na+K+-ATP 酶及 Ca2+Mg2+-ATP酶，嚴格按照試劑盒說明書進行操作[13]。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，單因素方差分析（One-way ANOVA）進行差異顯著性檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 試驗期間小鼠的一般狀況

在試驗過程中，各組小鼠精神狀態(tài)、食欲、睡眠均良好，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。黑靈芝多糖對小鼠體重的影響如表1所示，各組間無顯著差異。

2.2 黑靈芝多糖對小鼠負重游泳力竭時間的影響

黑靈芝多糖對小鼠負重游泳力竭時間的影響見圖1。

由圖1可知，與空白組比較，黑靈芝多糖低、中、高劑量組、陽性對照組小鼠負重游泳力竭時間顯著升高（P＜0.05），各組分別升高 37.4%、51.2%、60.3%、53.9%；與陽性對照組比較，黑靈芝多糖低劑量組小鼠負重游泳力竭時間降低10.8%，具有顯著性差異（P＜0.05），黑靈芝多糖中、高劑量組對負重游泳力竭時間的延長能力與陽性對照組相似。

表1 黑靈芝多糖對小鼠體重的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of GAP on body weight of mice（±s，n=10）

表1 黑靈芝多糖對小鼠體重的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of GAP on body weight of mice（±s，n=10）

組別 試驗初始體重/g第10天體重/g第20天體重/g第30天體重/g BC 21.32±1.65 25.72±1.50 29.02±1.83 32.16±2.17 AG 21.53±1.41 25.93±1.62 29.69±1.95 32.67±2.54 GAPL 21.61±1.23 25.51±1.37 29.46±1.64 32.08±2.16 GAPM 21.48±1.76 25.09±1.71 28.85±1.79 31.92±2.05 GAPH 21.59±1.57 25.38±1.76 29.17±2.07 32.43±2.71

圖1 黑靈芝多糖對小鼠負重游泳力竭時間的影響（±s，n=10）Fig.1 Effect of GAP on the time of weight-loading swimming exhaustion in mice（±s，n=10）

2.3 黑靈芝多糖對小鼠血清抗疲勞效果的影響

黑靈芝多糖對小鼠血清抗疲勞效果的影響見圖2。

圖2 黑靈芝多糖對小鼠血清抗疲勞效果的影響（±s，n=10）Fig.2 Effect of GAP on anti-fatigue of serum in mice（±s，n=10）

由圖2可知，與空白組比較，黑靈芝多糖組低、中、高劑量組、陽性對照組小鼠血清中葡萄糖含量顯著升高（P＜0.05），各組分別升高 17.6%、47.9%、58.9%、59.7%；乳酸含量各組顯著降低（P＜0.05），分別降低12.5%、19.0%、22.1%、19.4%；尿素氮含量各組顯著降低（P＜0.05），分別降低 8.7%、16.5%、20.1%、19.6%；肌酸激酶活力各組顯著降低（P＜0.05），分別降低19.5%、37.1%、39.9%、41.4%；乳酸脫氫酶活力各組顯著降低（P＜0.05），分別降低 6.2%、9.4%、11.2%、10.3%；與陽性對照組比較，黑靈芝多糖低劑量組血清中葡萄糖含量降低 26.4%，具有顯著性差異（P＜0.05）；乳酸含量、尿素氮含量、肌酸激酶活力和乳酸脫氫酶活力均顯著升高（P＜0.05），分別升高 8.6%、13.8%、37.5%、4.5%，黑靈芝多糖中、高劑量組對葡萄糖儲備的升高能力以及對乳酸含量、尿素氮含量、肌酸激酶活力和乳酸脫氫酶活力的降低能力與陽性對照組相似。

2.4 黑靈芝多糖對小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響

黑靈芝多糖對小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響見圖3。

由圖3可知，與空白組比較，黑靈芝多糖低、中、高劑量組、陽性對照組小鼠的肝糖原和肌糖原含量顯著升高（P＜0.05），肝糖原含量各組分別升高61.6%、83.7%、92.6%、87.5%，肌糖原含量各組分別升高25.3%、42.2%、51.8%、45.7%；與陽性對照組比較，黑靈芝多糖低劑量組肝糖原和肌糖原含量顯著降低（P＜0.05），分別降低13.8%、14.0%，黑靈芝多糖中、高劑量組對肝糖原和肌糖原儲備的升高能力與陽性對照組相似。

圖3 黑靈芝多糖對小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響（±s，n=10）Fig.3 Effect of GAP on the contents of liver glycogen and muscle glycogen in mice（±s，n=10）

2.5 黑靈芝多糖對小鼠血清和肝組織抗氧化效果的影響

黑靈芝多糖對小鼠血清和肝組織抗氧化效果的影響見圖4。

圖4 黑靈芝多糖對小鼠血清和肝組織抗氧化效果的影響（±s，n=10）Fig.4 Effect of GAP on antioxidation of serum and liver in mice（±s，n=10）

由圖4可知，與空白組比較，黑靈芝多糖低、中、高劑量組、陽性對照組小鼠血清和肝組織中丙二醛含量顯著降低（P＜0.05），隨著黑靈芝多糖劑量增加，丙二醛含量降低越明顯；與空白組比較，黑靈芝多糖低、中、高劑量組、陽性對照組小鼠血清和肝組織中超氧化物歧化酶活力、過氧化氫酶活力、谷胱甘肽過氧化物酶活力均顯著升高（P＜0.05），隨著黑靈芝多糖劑量增加，抗氧化酶活力升高越明顯；與陽性對照組比較，黑靈芝多糖低劑量組血清和肝組織中丙二醛含量顯著升高（P＜0.05），超氧化物歧化酶活力、過氧化氫酶活力、谷胱甘肽過氧化物酶活力均顯著降低（P＜0.05），黑靈芝多糖中、高劑量組對丙二醛含量的降低能力以及對超氧化物歧化酶活力、過氧化氫酶活力和谷胱甘肽過氧化物酶活力的升高能力與陽性對照組相似。

2.6 黑靈芝多糖對小鼠肝組織Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影響

黑靈芝多糖對小鼠肝組織Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影響見圖5。

由圖5可知，與空白組比較，黑靈芝多糖低、中、高劑量組、陽性對照組小鼠肝組織中Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP 酶活性顯著升高（P＜0.05），Na+K+-ATP酶活性各組分別升高12.8%、27.9%、30.4%、25.1%，Ca2+Mg2+-ATP酶活性各組分別升高15.9%、30.2%、31.7%、28.6%；與陽性對照組比較，黑靈芝多糖低劑量組肝組織中Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性顯著降低（P＜0.05），分別降低 9.8%、10.1%，黑靈芝多糖中、高劑量組對Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的升高能力與陽性對照組相似。

圖5 黑靈芝多糖對小鼠肝組織Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影響（±s，n=10）Fig.5 Effect of GAP on activities of Na+K+-ATPase and Ca2+Mg2+-ATPase in liver of mice（±s，n=10）

3 討論與結論

運動性疲勞是運動訓練中常見的現(xiàn)象，肝糖原、肌糖原、血乳酸、尿素氮、乳酸脫氫酶活力、肌酸激酶活力、抗氧化酶活力均反應機體的疲勞程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖低、中、高劑量組小鼠負重游泳力竭時間顯著高于空白組，表明黑靈芝多糖提高小鼠運動耐力，延長運動力竭的時間，延緩運動性疲勞的產生[15]。分析其原因發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖低、中、高劑量組小鼠力竭游泳后肝糖原、肌糖原、血清中葡萄糖含量均顯著高于空白組，血中乳酸、尿素氮含量、肌酸激酶活力和乳酸脫氫酶活力均顯著低于空白組，表明黑靈芝多糖可以有效增加肝糖原、肌糖原的儲備、減少運動中能源物質的消耗，節(jié)約蛋白質分解，降低乳酸、尿素氮等代謝物質的產生；緩解力竭運動中血清肌酸激酶和乳酸脫氫酶活力，避免由于其活力過高引起骨骼肌、心肌等組織損傷、壞死，保護肌組織，從而提高機體對力竭運動負荷的耐受能力，緩解運動性疲勞的程度[16]。

高強度長時間運動時體內耗氧量劇增，肝臟、骨骼肌和心肌等組織脂質過氧化反應加強，引起體內自由基產生增加[17]。自由基可與體內糖類、脂類、蛋白質和核酸等物質反應，破壞細胞結構和功能，體內抗氧化防御系統(tǒng)可以有效清除自由基，保持自由基動態(tài)平衡[18]。但力竭運動時，體內自由基產生的過快過多，抗氧化系統(tǒng)中的活性物質過多消耗，無法及時清理自由基，導致自由基與細胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應，生成具有細胞毒性的過氧化物，脂質過氧化物可自發(fā)分解成更多的自由基，引起自由基連鎖反應[19]。丙二醛是脂質過氧化的主要代謝產物，其含量升高提示體內抗氧化防御系統(tǒng)失衡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖低、中、高劑量組小鼠血清和肝組織中丙二醛含量顯著低于空白組，超氧化物歧化酶活力、過氧化氫酶活力、谷胱甘肽過氧化物酶活力均顯著高于空白組，表明黑靈芝多糖有效降低力竭運動中氧化應激反應，減少脂質過氧化物的產生，提高抗氧化酶的活力，降低氧化損傷的程度，維持機體正常的抗氧化防御系統(tǒng)[21]。

Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶分別驅動Na+/K+和Ca2+/Mg2+于細胞膜兩側雙向運輸，維持細胞膜電位，催化ATP分解為ADP供能，其活性反映機體能量代謝水平，機體自由基、運動、缺氧等狀況可影響ATP酶活性[22]。力竭運動中，體內過剩的自由基攻擊Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶，誘導其構象發(fā)生改變，使酶形成以碳原子為中心的自由基，降低酶的活性[23]。又由于自由基鏈式反應及丙二醛作用使細胞膜完整性和流動性改變，細胞內 Na+、Ca2+排出受阻，胞內 Na+、Ca2+濃度增加，導致細胞膜跨膜轉運功能失衡，影響細胞內外物質交換，降低氧的轉運能力，減少組織供氧，缺氧又加重自由基的損害作用，進一步降低ATP酶的活性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖低、中、高劑量組小鼠肝組織中Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性顯著高于空白組，表明黑靈芝多糖有效提高Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性，改善能量系統(tǒng)在力竭運動中的供能能力，提高機體的運動能力[25]。

綜上所述，黑靈芝多糖通過增加機體肝糖原和肌糖原的儲備、減少乳酸、尿素氮、丙二醛等代謝物質的積累、提高機體超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶系的活力以及Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性，增強機體運動能力，緩解運動性疲勞的程度，而且其功效與已具備改善運動性疲勞藥效的藥物相類似[26]。后續(xù)將對黑靈芝多糖抗氧化及抗疲勞機制進行深入研究，為黑靈芝多糖開發(fā)為提高運動能力及抗疲勞的運動營養(yǎng)劑提供科學依據(jù)。