藜麥種子EMS誘變條件初探

王育川,董艷輝,2,溫 鑫,李亞莉,侯麗媛,劉 江,趙 菁,曹秋芬,黃春國,吳慎杰,秦永軍,2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030031；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)研究院，太原 030031；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 太谷 030801)

藜麥(ChenopodiumquinoaWild)，藜科一年生草本植物，是原產(chǎn)南美洲安第斯山脈地區(qū)的一種天然偽谷物。作為當(dāng)?shù)匾环N重要的糧食作物，已經(jīng)有超過7 000年的種植歷史[1]。藜麥對于鹽堿、干旱、高海拔等較極端生境具有廣泛適應(yīng)性[2-3]，籽粒富含維生素、天然抗氧化劑和配比均衡的必需氨基酸等各類營養(yǎng)物質(zhì)，且為基本營養(yǎng)物質(zhì)的非過敏源，可供食物不耐受(例如麩質(zhì)不耐受)人群食用[4]，被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)認(rèn)定為21世紀(jì)人類營養(yǎng)最有前途的作物之一[5-6]，也是可能緩解全球糧食危機(jī)的一種谷物[7]。近年來，藜麥在世界各地廣泛引種種植[8]，但藜麥品質(zhì)與產(chǎn)量仍受品種自身特性、環(huán)境因素等制約，因此選育優(yōu)良品種對于藜麥發(fā)展十分必要。采用傳統(tǒng)的雜交及輪回選擇等方式，育種周期較長，人力、土地等資源消耗過大且不易選擇到目標(biāo)性狀。借助誘變及分子育種等新型方式操作相對簡單、特異性較強(qiáng)，容易獲得穩(wěn)定遺傳的突變體，這對于擴(kuò)充藜麥種質(zhì)資源庫、獲得優(yōu)良品種意義重大。

烷化劑EMS(甲基磺酸乙酯)作為一種最常用的化學(xué)誘變劑，成本較低、誘變效率較高，且較容易獲得傳統(tǒng)育種方式難以得到的性狀[9-10]，被廣泛應(yīng)用于植物和真菌中[11-12]。EMS誘變已成功應(yīng)用于小麥[13-14]、水稻[15]、玉米[16]、棉花[17]、番茄[18]、苦瓜[19]等作物中。藜科植物甜菜中也有研究[20]，并已經(jīng)獲得生物學(xué)性狀得到改變的株系[21-22]。藜麥中通過EMS誘變Regalona Baer品種得到對咪唑啉酮類除草劑高耐受性的株系[23]；也有研究篩選到下胚軸顏色異常的突變體[24]，這為藜麥種子進(jìn)行EMS誘變提供了可能。

本實(shí)驗(yàn)以自育白種藜麥干種子為試驗(yàn)材料，參考甜菜等作物種子的EMS誘變適宜濃度和處理時間，設(shè)置一系列濃度和時間梯度條件進(jìn)行誘變處理。通過連續(xù)統(tǒng)計種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率并進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計學(xué)的分析，最終確定EMS誘變藜麥種子的最佳條件，旨在創(chuàng)制藜麥新種質(zhì)，為后續(xù)誘變并構(gòu)建藜麥突變體庫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試種子為山西靜樂白種藜麥(暫定靜樂白-02)，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(原山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心)自行選育。藜麥植株種植于山西省靜樂縣娑婆鄉(xiāng)長棱角村。種子于上一年9月下旬至10月上旬收獲，經(jīng)晾曬干燥、脫粒并去除雜質(zhì)后保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)用EMS原液原產(chǎn)Sigma公司，其它試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)分別用5個EMS濃度(V/V)0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，4個時間梯度(8 h、10 h、12 h、14 h)進(jìn)行誘變處理。每個處理時間均設(shè)置2個對照組，分別為蒸餾水對照組(ck1)和磷酸緩沖液對照組(ck2)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置28個處理，每處理3次重復(fù)。

1.2.1溶液配制

0.1 mol·L-1磷酸緩沖液：分別配制0.2 mol·L-1的Na2HPO4、NaH2PO4作為母液，工作液按照Na2HPO4∶ NaH2PO4=67∶33體積比混合后稀釋而成。

不同濃度EMS-磷酸緩沖液分別由EMS原液與0.1 mol·L-1磷酸緩沖液按照體積比混合配制而成。

0.1 mol·L-1Na2S2O3溶液配制：稱取26 g Na2S2O3·5 H2O 固體溶解于加熱煮沸后冷卻的蒸餾水中，再加入0.2 g Na2CO3粉末，完全溶解后定容至1 L，盛裝于預(yù)先滅菌的棕色瓶中密封、避光保存。

1.2.2實(shí)驗(yàn)流程

誘變詳細(xì)流程如下：

選種：挑選飽滿、無損且未發(fā)芽的藜麥種子，每100粒一組分裝于5 mL離心管中備用。

浸種：預(yù)先用蒸餾水清洗種子2次，然后室溫(19～21 ℃)蒸餾水浸種2 h。

誘變處理：向控干水分的各管中分別加入3 mL對應(yīng)濃度的EMS-磷酸緩沖液(ck1加等量蒸餾水，ck2加等量磷酸緩沖液)，黑色塑料袋包裹后置于水平搖床(100 r·min-1)，室溫黑暗處理相應(yīng)時間。

誘變終止：棄廢液，向管內(nèi)加入3 mL Na2S2O3溶液靜置10 min以終止反應(yīng)。

漂洗：棄終止劑，加滿蒸餾水輕輕顛倒沖洗，至少沖洗4次，每次10 min。

點(diǎn)種：種子瀝干后，分組置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中4 ℃冷藏過夜，次日，點(diǎn)種于預(yù)先攪拌好的基質(zhì)中進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)：為防止EMS對環(huán)境造成不良影響，廢液以及沾染過EMS的器皿收集后加0.1 M Na2S2O3溶液中和過夜，再用大量清水沖洗。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以藜麥種子下胚軸破土作為萌發(fā)的種子進(jìn)行計數(shù)，以點(diǎn)種當(dāng)天作為第0天，從第1天開始每天14：00—18：00觀察并記錄發(fā)芽情況。相關(guān)統(tǒng)計指標(biāo)如下：

相對致死率(%)=(1-相對發(fā)芽率)×100%。

原始數(shù)據(jù)記錄在Microsoft Excel軟件上進(jìn)行，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，Origin 8軟件作圖，使用DPS 7.05軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對藜麥種子萌發(fā)動態(tài)的影響

盡管各組種子在點(diǎn)種時芽已經(jīng)開始伸長，但點(diǎn)種當(dāng)天均沒有萌出基質(zhì)。點(diǎn)種后第1天開始，陸續(xù)開始破土萌發(fā)。最早出苗的是ck1、ck2和0.5%濃度處理組。其中，ck1和ck2在8 h及14 h下，第1天起始萌出，其余兩個處理時間在第2天起始萌出，0.5%濃度的處理組則相反；從1%處理組開始，起始萌發(fā)時間推遲，具體表現(xiàn)在除1%、8 h在第2天而2%、14 h，2.5%、14 h等濃度高、時間長的組合始終未萌發(fā)外，其余組合均在第3天以后開始萌發(fā)，且隨著濃度升高、作用時間延長，推遲萌發(fā)時間越久，到第8天，萌發(fā)起始完全；直至第14天，各處理組出苗數(shù)基本穩(wěn)定。

觀察發(fā)現(xiàn)，對照組、0.5%組及1%、8 h組萌發(fā)高峰期集中在第2天，其余組合均在第3天后，且萌發(fā)高峰期表現(xiàn)出與起始萌發(fā)時間一致的趨勢。統(tǒng)計表明，對照組萌發(fā)起始到發(fā)芽數(shù)穩(wěn)定只需要1～2 d，EMS濃度組種子萌發(fā)較不整齊，集中萌發(fā)時間可延長至4～6 d。匯總各組合累計發(fā)芽數(shù)為圖1，在整個統(tǒng)計周期內(nèi)，EMS處理組發(fā)芽總數(shù)也較對照減少。方差分析結(jié)果顯示，除0.5%濃度組外，EMS濃度對種子初始萌發(fā)時間和萌發(fā)高峰期均產(chǎn)生極顯著影響(p<0.01)，然而不同處理時間影響并不顯著(p>0.05)。

2.2 不同處理對藜麥種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響

由于各處理組種子萌發(fā)高峰期不盡相同，最后出苗組合在第9天左右達(dá)到萌發(fā)高峰，故以第9天種子累計發(fā)芽數(shù)計算發(fā)芽勢。經(jīng)統(tǒng)計，對照組ck1和ck2發(fā)芽勢最高，平均值分別為89.7%、89.6%，且二者之間差異不顯著；EMS處理組中除0.5%濃度組合及1%、8 h組合外，發(fā)芽勢都較對照組顯著降低(圖2-A)，且在同一處理時間下，隨著濃度的升高，發(fā)芽勢呈降低趨勢，2%、12 h與2.5%的8 h、10 h處理相對發(fā)芽勢分別為1.1%、3.7%、1.5%，2%、14 h以及12 h、14 h處理相對發(fā)芽勢為0(圖2-C)，這說明當(dāng)EMS濃度提高到一定程度時，EMS對藜麥種子發(fā)芽勢有顯著的抑制作用。對比相同EMS濃度條件下不同處理時間的種子發(fā)芽勢，可以看出，除0.5%、14 h，1.5%、10 h兩個組合外，其他組合隨著時間延長，發(fā)芽勢呈下降趨勢(圖2-A)。這兩個組合的例外可能預(yù)示著EMS濃度及處理時間兩個因素間存在互作。

選取出苗數(shù)目基本穩(wěn)定的第14天作為統(tǒng)計發(fā)芽率的時間。據(jù)圖2-B、2-D可知，種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢表現(xiàn)趨勢基本一致。同樣發(fā)現(xiàn)，高濃度EMS對藜麥種子發(fā)芽率抑制作用顯著。而在0.5%、8 h，0.5%、10 h及1%、8 h等低濃度短時間的組合中，發(fā)芽勢和發(fā)芽率與對照差異不顯著，表明藜麥種子對EMS低濃度可能不敏感。對比0.5%及1.5%濃度組的發(fā)芽勢情況，發(fā)現(xiàn)其發(fā)芽率也分別呈現(xiàn)8 h>10 h>14 h>12 h和10 h>8 h>12 h>14 h的趨勢，即同一EMS濃度下，隨著時間的延長，發(fā)芽勢與發(fā)芽率的降低趨勢并不是線性的。這再次說明，藜麥種子EMS誘變實(shí)驗(yàn)中，濃度與處理時間之間可能存在互作關(guān)系。

為了評價實(shí)驗(yàn)中EMS濃度與誘變處理時間對藜麥種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的效用，進(jìn)行了雙因素方差分析。據(jù)表1所示，EMS誘變劑濃度和處理時間對藜麥種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢以及相對發(fā)芽率均影響極顯著，且二者間的互作也達(dá)到了極顯著的水平(p<0.01)。表明種子發(fā)芽率的降低是誘變濃度與時間共同作用的結(jié)果。因此，選擇誘變藜麥種子的適宜條件時，應(yīng)綜合考慮這兩個因素。誘變實(shí)驗(yàn)中，公認(rèn)發(fā)芽率降低到50%的半致死率是衡量不同誘變處理效果的重要參數(shù)。通常認(rèn)為半致死劑量為適宜誘變條件。本實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先浸種2 h，1.5%、12 h的組合平均相對發(fā)芽率為51.3%，其相對致死率48.7%接近半致死率。此外，2%濃度處理8 h和10 h致死率較接近半致死劑量(相對致死率分別為45%、55%)。

表1 藜麥種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的方差分析Table 1 Variance analysis of seed germination potential and germination rate of C.quinoa

3 結(jié)論與討論

目前，已經(jīng)有多種育種方式應(yīng)用到藜麥種質(zhì)資源創(chuàng)新及改良中，然而誘變相關(guān)的報道還很少。2013年秘魯首次利用γ射線輻射誘變藜麥干種子，得到株高、生育期、株型葉形等形態(tài)學(xué)指標(biāo)發(fā)生改變甚至種子顏色變化的植株[25]。隨后的研究中，他們成功得到了具有穩(wěn)定的矮化、高產(chǎn)、生育期縮短、高蛋白、皂苷含量降低等表型的品系[26]?；瘜W(xué)誘變中，經(jīng)疊氮化鈉(NaN3)處理獲得了高皂苷、高蛋白的突變體[27]。與其他誘變方式相比，EMS作為一種被成熟應(yīng)用的化學(xué)誘變劑，誘變后突變頻率較高，且多為顯性點(diǎn)突變，有利于突變體的獲得和篩選。而其在藜麥僅有的報道中，并沒有最適誘變條件探究。本實(shí)驗(yàn)首次系統(tǒng)探究了藜麥種子誘變的適宜條件。通過設(shè)置不同EMS濃度及處理時間，綜合考慮二者的影響，以半致死條件LD50為適宜條件原則，確定預(yù)先浸泡2 h后，1.5%濃度處理12 h為適宜條件。另外，2%濃度條件下分別處理8 h及10 h相對致死率也較接近半致死劑量，處理時可酌情進(jìn)行選擇。與谷子[28]、糜子[29]等小顆粒種子作物相比，藜麥種子對誘變劑EMS響應(yīng)的初始濃度更高。這可能與藜麥抗逆性較強(qiáng)的特性有關(guān)。相應(yīng)的處理時間也較長，這一點(diǎn)在與藜麥親緣關(guān)系較近的甜菜[22]中也有體現(xiàn)。

適宜條件在預(yù)實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)(實(shí)驗(yàn)材料為不同品種的白藜麥種子，暫定靜樂白-01)。然而，在前期的浸種探究中發(fā)現(xiàn)，紅藜麥、黑藜麥的種子與白藜麥種子相比，無論在吸水還是萌發(fā)上都需要更長的時間，原因可能是不同顏色藜麥種子種皮品質(zhì)有所差異。這也許預(yù)示著，不同顏色藜麥種子進(jìn)行EMS誘變時，適宜條件有所不同。一般而言，紅、黑種藜麥可能需要適當(dāng)延長浸種或處理時間。但處理時間并不能無限延長。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，當(dāng)處理時間延長到12 h、14 h時，一些組合種子已經(jīng)不萌發(fā)。Tropa-Castillo S J[23]的研究也發(fā)現(xiàn)，處理時間達(dá)到16 h之后，2% EMS濃度下發(fā)芽率顯著降低，3%濃度下甚至表現(xiàn)為不萌發(fā)，這可能與藜麥對多余水分的敏感性有關(guān)。另外，盡管藜麥為抗逆性很強(qiáng)的植物，但EMS濃度也需控制在一定范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)證明，較高濃度的EMS條件下，種子初始萌發(fā)時間和萌發(fā)高峰期延遲，發(fā)芽勢和發(fā)芽率也隨之降低甚至在整個統(tǒng)計周期表現(xiàn)不萌發(fā)。除此之外，藜麥種子進(jìn)行EMS誘變處理時有必要選擇較為適宜的溫度。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選擇比本實(shí)驗(yàn)處理溫度較高的28 ℃恒溫處理，由于藜麥種子極易萌發(fā)的特性，種子平均只需要6～7 h即可萌發(fā)，誘變劑作用時間相對不充足；而置于4 ℃冷藏處理，對低溫具有耐受性的藜麥種子平均需要48 h才能萌發(fā)，一些品種甚至不能萌發(fā)。低溫下，盡管EMS的穩(wěn)定性得以保證，但一定溫度范圍內(nèi)，溫度的升高，有利于突變頻率的提高[30]，因此為了適當(dāng)提升EMS的效用，本實(shí)驗(yàn)采用19～21 ℃室溫處理，且預(yù)先浸泡2 h以增加藜麥種皮對誘變劑的通透性。綜上，針對不同藜麥種子的誘變，需要在了解種子自身特性的基礎(chǔ)上，對本實(shí)驗(yàn)適宜條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

藜麥種子EMS誘變條件的初步確定，為開展藜麥種子誘變育種工作提供了參考，也為人工誘變創(chuàng)制和改良藜麥種質(zhì)資源工作奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而在實(shí)驗(yàn)條件下，除了要考慮半致死率之外，還需要綜合考慮M1、M2代等的畸變率；實(shí)際生產(chǎn)中，也要考慮浸泡種子出苗率等因素，從而選擇合適的處理?xiàng)l件進(jìn)行定向選擇。