慢性阻塞性肺疾病患者血清mir-210、HIF-1α表達(dá)水平及意義

蔡燕

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)簡(jiǎn)稱慢阻肺，是一種常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，主要臨床特征為呼吸氣流受限[1]、咳嗽、胸悶，其中急性加重期患者若病情控制不當(dāng)，可能發(fā)展為肺功能衰弱，最終導(dǎo)致呼吸衰竭[2]。據(jù)報(bào)道低氧和氣道炎癥是COPD疾病的相關(guān)影響因素[3]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hxpoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在低氧狀態(tài)下的細(xì)胞中能夠高表達(dá)，能夠適應(yīng)機(jī)體缺氧，參與缺氧性肺動(dòng)脈高壓、炎性因子的表達(dá)等[4]，在COPD疾病發(fā)生發(fā)展中起到重要推動(dòng)作用。另有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA能通過(guò)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞中促炎因子釋放，導(dǎo)致肺部疾病病情加重[5]。然而有關(guān)mir-210和HIF-1α在水平變化對(duì)COPD疾病影響研究較少，本文擬探究mir-210、HIF-1α在COPD血清表達(dá)情況，并分析其在早期預(yù)防COPD的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2016年10月至2018年10月收治的COPD患者88例，其中急性加重期(急性加重期COPD組)43例，男24例，女19例；年齡55～70歲，平均年齡(61.20±9.34)歲；穩(wěn)定期(穩(wěn)定期COPD組)45例，男25例，女20例；年齡50～75歲，平均年齡(64.50±6.87)歲。選取本院體檢健康者45例，男25例，女20例；年齡48～76歲，平均年齡(65.30±8.64)歲。3組年齡、性別比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合COPD診治指南(2013年修訂版)；(2)1個(gè)月內(nèi)無(wú)胸腔及其他手術(shù)者；(3)近3個(gè)月未注射免疫抑制劑者；(4)自愿參與本臨床試驗(yàn)，同意簽署臨床研究協(xié)議書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有腎、肝、心功能障礙患者；(2)患有有關(guān)支氣管擴(kuò)張、支氣管哮喘、肺部疾病患者；(3)患有其他部位感染患者；(4)有長(zhǎng)期激素治療患者；(5)精神疾病患者。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.3 主要試劑及儀器 人HIF-1α ELISA試劑盒，上海廣銳生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒，德國(guó)Promega公司；RNA提取試劑盒，日本TaKaRa公司；Masterscreen Diffusion型肺功能檢測(cè)儀，德國(guó)JAEGER公司；278型血液氣體分析儀；美國(guó)康寧；Multiskan Sky全自動(dòng)酶標(biāo)儀、PikoReal熒光定量PCR儀，美國(guó)賽默飛世爾公司；eppendorf冷凍低速離心，德國(guó)Eppendorf公司。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集:所有受試者入院后或體檢當(dāng)天空腹采集靜脈血8 ml，靜置10 min，3 000 r/min，4℃，10 cm半徑離心20 min。收集上清液。

1.4.2 指標(biāo)檢測(cè):①HIF-1α水平檢測(cè)：依照人HIF-1α ELISA試劑盒操作步驟采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清HIF-1α水平。②肺功能檢查：用肺功能儀檢測(cè)用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、第1秒用力呼氣量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)、用力呼氣中期流速(maximal mid-expiratory flow curve，MMEF)和呼氣峰值流速(peakexpiratoryflow，PEF)。③血?dú)夥治觯河酶嗡鼗⑸淦鞒槿∷惺茉囌邩飫?dòng)脈血0.5 ml，用血液氣體分析儀進(jìn)行血?dú)夥治觥?/p>

1.4.3 熒光定量PCR檢測(cè)血清mir-210的表達(dá)水平:用RNA試劑盒提取血清中總RNA，核算蛋白分析儀測(cè)定260/280值為1.9～2.0，證明RNA濃度良好。反轉(zhuǎn)錄cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆?。mir-210和內(nèi)參引物送與上海生工合成。qRT-PCR反應(yīng)體系20 μl：2×STBR Master Mix 12.5 μl，模板cDNA(50 ng/μl)1 μl，正向引物 1.0 μl，反向引物1.0 μl，ddH2O 4.5 μl。反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃，20 s；62℃，30 s；72℃，35 s；30個(gè)循環(huán)。對(duì)mir-210相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT法計(jì)算。見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定期COPD組和急性加重COPD組血清miR-210表達(dá)水平和HIF-1α水平 對(duì)照組、穩(wěn)定期COPD組、急性加重期COPD組患者血清mir-210表達(dá)水平和HIF-1α水平，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，穩(wěn)定期COPD組、急性加重期COPD組患者血清mir-210表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HIF-1α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與穩(wěn)定期COPD組比較，急性加重期COPD組患者血清mir-210表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HIF-1α水平明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 COPD患者血清miR-210表達(dá)水平和HIF-1α水平比較

2.2 3組血?dú)庵笜?biāo)比較 與對(duì)照組比較，穩(wěn)定期COPD組、急性加重期COPD組患者血?dú)庵笜?biāo)PaO2顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PaCO2顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與穩(wěn)定期COPD組比較，急性加重期COPD組患者血?dú)庵笜?biāo)PaO2顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PaCO2顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組血?dú)庵笜?biāo)比較

2.3 2組肺功能FVC、FEV1/FVC、MMEF和PEF指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，穩(wěn)定期COPD組、急性加重期COPD組患者肺功能指標(biāo)FVC、FEV1/FVC、MMEF和PEF顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與穩(wěn)定期COPD組比較，急性加重期COPD組患者肺功能指標(biāo)FVC、FEV1/FVC、MMEF和PEF顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 2組肺功能指標(biāo)比較

2.4 COPD患者血清miR-210表達(dá)水平與HIF-1α水平相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示COPD患者血清miR-210表達(dá)水平與HIF-1α水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.648，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 COPD患者血清miR-210表達(dá)水平與HIF-1α水平相關(guān)性分析

2.5 COPD患者血清mir-210表達(dá)水平、HIF-1α水平與肺功能、血?dú)庵笜?biāo)的相關(guān)性分析 COPD患者血清mir-210表達(dá)水平與FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF、PaO2水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與PaCO2水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。COPD患者血清HIF-1α水平與FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF、PaO2水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與PaCO2水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 Pearson相關(guān)性分析

3 討論

COPD是一種臨床上常見(jiàn)肺部慢性疾病，多以低氧血癥為先發(fā)征兆[6]。有研究報(bào)道炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等在COPD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用，然而COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具體機(jī)制不清楚[7]。

據(jù)報(bào)道COPD患者呼吸功能與炎性因子有關(guān)，肺功能指標(biāo)和血?dú)庵笜?biāo)可評(píng)價(jià)患者呼吸功能，其中FEV1/FVC和PEF可反應(yīng)氣道阻塞的程度[8]，PaO2可反映患者血氧分壓。馬原等[9]研究發(fā)現(xiàn)COPD患者肺功能指標(biāo)FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和血?dú)庵笜?biāo)PaO2顯著降低，PaCO2顯著上升。劉林林等[10]研究發(fā)現(xiàn)急性加重期COPD患者血?dú)庵笜?biāo)PaO2顯著下降，PaCO2顯著上升。徐繼勛等[11]發(fā)現(xiàn)COPD患者肺功能指標(biāo)FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF顯著低于對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期COPD組和急性加重期COPD組患者FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2顯著低于對(duì)照組，PaCO2顯著高于對(duì)照組，提示COPD疾病可能對(duì)機(jī)體呼吸功能有影響，COPD患者均存在一定程度呼吸功能障礙。與穩(wěn)定期COPD組比較，急性加重期COPD組患者FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2顯著降低，PaCO2顯著升高，提示呼吸功能受損害程度可能與COPD病情進(jìn)展有關(guān)。

雖然肺功能指標(biāo)能一定程度評(píng)估COPD患者病情，但預(yù)測(cè)患者病情靈敏度具有一定局限性[12]。HIF-1α水平能夠反映機(jī)體缺氧缺血程度，HIF-1α也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧環(huán)境形成。陶洪臣等[13]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在COPD患者血清中水平顯著高于肺功能正常組，推測(cè)HIF-1α水平增加與COPD患者肺功能障礙有關(guān)。李芳等[6]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中水平明升高。戈艷蕾等[14]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在COPD患者血清中水平明顯高于對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在穩(wěn)定期COPD組和急性加重期COPD組患者血清中水平顯著高于對(duì)照組，提示HIF-1α可能在COPD疾病發(fā)展中有一定作用。與穩(wěn)定期COPD組比較，HIF-1α在急性加重期COPD組患者血清中顯著升高，提示HIF-1α可能與COPD病情嚴(yán)重密切相關(guān)。進(jìn)一步Pearson相關(guān)分析顯示，HIF-1α與FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2呈負(fù)相關(guān)性，與PaCO2呈正相關(guān)性。提示血清HIF-1α水平變化可能對(duì)COPD患者呼吸功能有重要影響。

研究發(fā)現(xiàn)，mir-210與肺炎、哮喘、COPD等各種呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[15]。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)mir-210在肺癌組患者血漿表達(dá)水平顯著低于COPD組，猜想mir-210可能與COPD發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)mir-210在老年COPD患者外周血中表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn)mir-210表達(dá)水平在穩(wěn)定期COPD組和急性加重期COPD組患者血清中顯著降低，提示mir-210可能在COPD疾病發(fā)生具有一定作用。急性加重期COPD組患者血清中mir-210表達(dá)水平顯著低于穩(wěn)定期COPD組，提示mir-210表達(dá)水平變化可能與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)mir-210與FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2存在正相關(guān)性，與PaCO2存在負(fù)相關(guān)性，提示COPD患者mir-210表達(dá)水平變化可能一定程度上也影響患者呼吸功能。章輝等[18]研究發(fā)現(xiàn)在低氧條件下，大鼠氣道平滑肌細(xì)胞miR-199-5p表達(dá)減少，HIF-1α水平增加，推測(cè)miR-199-5p可能能抑制低氧條件下HIF-1α水平增加。本文研究發(fā)現(xiàn)COPD患者血清mir-210表達(dá)水平與HIF-1α存在負(fù)相關(guān)性，提示mir-210與HIF-1α可能存在相互作用關(guān)系，共同參與COPD疾病發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，HIF-1α在COPD患者血清中呈高表達(dá)，mir-210呈低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)，均與肺功能指標(biāo)及血?dú)庵笜?biāo)水平相關(guān)，可能與COPD疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究尚待繼續(xù)探討mir-210與HIF-1α如何相互作用影響COPD疾病。