子宮肌瘤患者血清miR-21的表達及與ER、PR的相關性研究

李燕華 吳小芳 張利容 安銀華 鄧夏 劉玲玲 孫華

子宮肌瘤是由子宮平滑肌增生引起的良性腫瘤，是女性生殖器官常見疾病。子宮肌瘤多發(fā)于30～50歲女性，且發(fā)病率有逐年上升趨勢，精神壓力大、環(huán)境衛(wèi)生差、內(nèi)分泌失調(diào)、晚育、妊娠、生殖道炎癥等均能影響子宮肌瘤發(fā)病[1]。有研究表明，子宮肌瘤是一種激素依賴性腫瘤，雌激素、孕激素均與子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展有關[2]。Grings等[3]研究報道，雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)在子宮肌瘤組織中過表達，促進子宮平滑肌瘤生長。有研究發(fā)現(xiàn)，降低ER水平可減小子宮肌瘤體積，有效抑制子宮肌瘤進展[4]。Tsigkou等[5]研究證實，子宮肌瘤組織中孕激素受體(Progesterone Receptor，PR)表達水平明顯高于正常子宮肌層組織，與患者年齡、肌瘤數(shù)量有關，PR信號可能有利于子宮肌瘤生長。PR拮抗劑可抑制子宮肌瘤增殖，可用于子宮肌瘤臨床治療[6]。有研究表明，miR-21在肝癌患者血清中高表達，與腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者5年生存率有關[7]。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-21表達可抑制宮頸癌細胞增殖、促進凋亡，抑制腫瘤生長。然而miR-21在子宮肌瘤患者中作用尚未有研究，本研究通過檢測子宮肌瘤患者血清中miR-21表達水平，分析其與ER、PR表達水平及臨床病理特征關系，探究miR-21在子宮肌瘤中意義，為子宮肌瘤臨床治療提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2019年1月本院收治的子宮肌瘤患者118例，患者年齡29～61歲，平均(47.63±8.54)歲。入組患者按組織學分型分為：肌壁間肌瘤37例，漿膜下肌瘤42例，黏膜下肌瘤39例。另選擇同期因子宮脫垂行子宮切除術患者118例作為正常子宮肌層組，年齡28～60歲，平均(47.02±8.31)歲。2組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準同意。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①經(jīng)臨床及病理切片診斷為子宮肌瘤且需行子宮肌瘤切除術者；② 3個月內(nèi)未使用激素類藥物；③患者及其家屬知情并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①合并患有糖尿病、甲狀腺功能異常類疾病者；②合并患有惡性腫瘤者；③患有嚴重精神疾病者。

1.3 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號：JL1256，德國Qiagen公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：205311，德國Qiagen公司)、實時熒光定量(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號：208054，德國Qiagen公司)、兔抗人ER多克隆抗體(貨號：ABP0086，Abbkine生物技術有限公司)、兔抗人PR多克隆抗體(貨號：ABP55583，Abbkine生物技術有限公司)、羊抗兔IgG二抗(貨號：QN2732-PWV，北京百奧萊博科技有限公司)、免疫組織化學染色試劑盒(貨號：YDJ4123，上海羽朵生物科技有限公司)、qRT-PCR儀(型號：7500 Fast，美國ABI公司)、光學顯微鏡(型號：DCM8，德國徠卡公司)。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集:術前清晨7∶00～9∶00采集所有入組者空腹時外周靜脈血，3 000 r/min離心20 min，取上清液分裝于無菌EP管中，-20℃保存?zhèn)溆?。術中分別收集子宮肌瘤患者子宮肌瘤組織及子宮脫垂患者正常子宮肌層組織，液氮迅速冷凍后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 qRT-PCR檢測血清中miR-21、ER mRNA、PR mRNA表達水平:使用試劑盒提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，進行qRT-PCR。20 μl反應體系如下：SYBR Green PCR Mix 10 μl、ROX Dye 0.1 μl、上、下游引物各2 μl、cDNA 2 μl、RNase-free水3.9 μl。反應步驟如下：95℃ 2 min，1個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 10 s，38個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算miR-21、ER mRNA、PR mRNA相對表達量。見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.4.3 免疫組織化學染色檢測組織中ER、PR蛋白水平:按照免疫組化染色試劑盒說明書步驟進行實驗。最終切片在光學顯微鏡下進行觀察，并選取400倍鏡下5個視野進行ER、PR蛋白陽性細胞計數(shù)。細胞核中呈棕黃色或棕褐色為ER蛋白陽性細胞，細胞質(zhì)中呈棕黃色或棕褐色為PR蛋白陽性細胞。染色結(jié)果評分標準：按照染色強度和陽性細胞所占百分比記分。①染色強度：無色為、淡黃色為、棕黃色、棕褐色分別記為0分、1分、2分、3分。②陽性細胞所占百分比：<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別記為0分、1分、2分、3分、4分。兩者記分相乘，≤3分為陰性表達，>3分為陽性表達。

2 結(jié)果

2.1 2組miR-21、ER mRNA、PR mRNA表達水平比較 miR-21、ER mRNA、PR mRNA在子宮肌瘤組患者血清中表達水平均顯著高于正常子宮肌層組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組miR-21表達水平比較

2.2 2組ER、PR蛋白表達水平比較 ER蛋白陽性表達主要定位于細胞核中，PR蛋白陽性表達主要定位于細胞質(zhì)中。ER蛋白、PR蛋白在子宮肌瘤組織中陽性表達率均顯著高于正常子宮肌層組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 2組ER、PR蛋白表達水平比較 n=118，例

ER蛋白陽性表達 ER蛋白陰性表達 PR蛋白陽性表達 PR蛋白陰性表達

2.3 子宮肌瘤患者miR-21表達水平比較 ER陰性組miR-21表達水平顯著低于ER陽性組(P<0.05)，PR陰性組miR-21表達水平顯著低于PR陽性組(P<0.05)。見表4。

表4 不同ER、PR表達組子宮肌瘤患者miR-21水平比較

2.4 不同水平miR-21、ER、PR子宮肌瘤患者臨床病理特征比較 子宮肌瘤患者血清miR-21及子宮肌瘤組織ER蛋白、PR蛋白表達水平均與年齡、肌瘤直徑、組織學分型無關(P>0.05)，與肌瘤數(shù)目、陰道不規(guī)則出血、月經(jīng)周期有關(P<0.05)。見表5。

表5 不同水平miR-21、ER、PR子宮肌瘤患者臨床病理特征比較 例

2.5 子宮肌瘤患者血清miR-21與ER mRNA、PR mRNA相關性 子宮肌瘤患者血清miR-21表達水平與ER mRNA表達水平呈正相關(r=0.422，P=0.000)，與PR mRNA表達水平呈正相關(r=0.419，P=0.000)。見圖2、3。

圖2 子宮肌瘤患者血清miR-21與ER mRNA水平相關性

圖3 子宮肌瘤患者血清miR-21與PR mRNA水平相關性

3 討論

子宮肌瘤患者多無明顯癥狀，但多數(shù)患者可能伴有白帶異常、痛經(jīng)、貧血、腹部包塊、子宮出血等，影響患者日常生活質(zhì)量。雖然子宮肌瘤為良性腫瘤，但也有惡變可能，需引起患者重視[9]。目前關于影響子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展中相關因素尚不明確，探尋相關因子調(diào)控作用對控制子宮肌瘤病情發(fā)展，改善患者生活質(zhì)量有一定意義。

人體內(nèi)雌激素由人卵巢和胎盤分泌，能促進女性第二性征發(fā)育及性成熟，與人體生長、內(nèi)分泌及心血管代謝密切相關。雌激素分泌持續(xù)易在短時間內(nèi)引起子宮內(nèi)膜增生過多，進而引發(fā)子宮肌瘤。人體內(nèi)孕激素由卵巢黃體細胞分泌，能抑制排卵、促進乳腺腺泡生長、松弛血管及促進子宮內(nèi)膜增生，與雌激素作用相似，二者存在相互作用[10]。雌激素、孕激素均可分別與ER、PR特異性結(jié)合，發(fā)揮其生物學效應。Le?o等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與萎縮的子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜息肉中ER、PR表達水平增加。M?kinen等[12]研究表明，子宮肌瘤組織中ER、PR呈陽性，ER、PR水平能在一定程度上為臨床靶向治療和病情改善提供一定依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，與正常子宮肌層組織相比，ER蛋白、PR蛋白在子宮肌瘤組織中陽性表達率均顯著升高，與M?kinen等[12]研究結(jié)果一致，提示ER、PR表達水平變化與子宮肌瘤發(fā)生有關。研究報道，ER、PR表達與子宮體積變化有關[13]。ER蛋白在子宮內(nèi)膜增生期表達明顯高于分泌期[14]。Mohammed等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ER在可通過靶向PR基因，影響乳腺癌臨床病理特征。本研究發(fā)現(xiàn)，與肌瘤數(shù)目、陰道不規(guī)則出血、月經(jīng)周期有關，提示ER、PR與子宮肌瘤進展有關，ER、PR可能通過促進細胞增殖和生長，引起子宮內(nèi)膜增生，影響子宮肌瘤增多及體積增大，促進子宮肌瘤發(fā)展。

有研究表明，子宮內(nèi)膜癌患者血清中miR-21表達水平顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織，與浸潤深度、病灶大小有關[16]。本研究結(jié)果顯示，miR-21在子宮肌瘤患者血清中表達水平顯著高于正常子宮肌層組，與蔡如玉等[16]在子宮內(nèi)膜癌中研究結(jié)果相似，提示miR-21可能與子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展有關。有研究報道，miR-21可促進氣道平滑肌細胞增殖和遷移[17]。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21上調(diào)可促進子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，子宮肌瘤患者血清中miR-21表達水平與肌瘤數(shù)目、陰道不規(guī)則出血、月經(jīng)周期有關，提示子宮肌瘤中miR-21表達影響子宮肌瘤進展。

有研究表明，乳腺癌組織中miR-181a、miR-23、miR-26表達水平均顯著低表達，PR陽性患者三者表達水平均顯著低于PR陰性患者，過表達三種miRNA可下調(diào)PR mRNA表達[19]。張廣平等[20]研究報道，miR-200a可通過靶向ER抑制子宮內(nèi)膜癌細胞生長。以上研究提示miRNA可通過靶向ER、PR促進腫瘤細胞生長增殖，影響腫瘤進程。Petrovic等[21]研究發(fā)現(xiàn)，ER、PR陽性乳腺癌患者miR-21水平高于ER、PR陰性乳腺癌患者，患者miR-21水平與ER、PR水平呈正相關。本研究結(jié)果顯示，子宮肌瘤患者血清中，與ER、PR陰性組相比，ER、PR陽性組患者miR-21表達水平顯著升高，與Petrovic等在乳腺癌中研究結(jié)果一致，提示miR-21與ER、PR可能存在相互作用機制，共同參與子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展。但具體作用機制尚需進一步深入研究。

綜上所述，子宮肌瘤患者血清中miR-21、ER、PR表達水平均顯著升高，三者表達水平均與與肌瘤數(shù)目、陰道不規(guī)則出血、月經(jīng)周期有關。miR-21表達水平均與ER、PR水平呈正相關，三者間可能相互作用，共同影響子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展。但由于本研究方法較為基礎，樣本量較少，三者機體協(xié)同表達機制還需大量樣本和實驗深入研究。