miR-186-5p靶向TrkB-T1抑制食管癌細(xì)胞遷移、侵襲的機制研究

王捷 張亞楠 張瑜 高旭輝

食管癌(esophageal cancer)是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，其為中國癌癥死亡的第四大原因[1]。盡管由于診斷、手術(shù)和放化療技術(shù)的不斷進展，但其化學(xué)抗性和轉(zhuǎn)移傾向仍是影響食管癌預(yù)后的主要原因[2]。隨著對癌癥生物學(xué)的進一步研究，越來越多的研究人員開始探索新的治療方法，miRNA、siRNA或核酶的寡核苷酸療法的特異性和安全性得到關(guān)注。miRNA是長度在18～24個核苷酸之間的短鏈非編碼內(nèi)源性微小RNA，其參與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。miR-186-5p在多種癌癥中均下調(diào)，發(fā)揮抑制癌癥進一步惡化的作用[4]，但是其在食管癌中的作用及機制尚未十分清楚。神經(jīng)營養(yǎng)因子受體B(TrkB-T1)是一種145 kDa受體酪氨酸激酶，是人類癌癥中腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5]。失調(diào)的TrkB-T1在多種癌癥的進程中均具有重要作用[6,7]。本研究以食管癌細(xì)胞ECA109為研究對象，檢測其中miR-186-5p、TrkB-T1的表達，觀察過表達miR-186-5p、敲減TrkB-T1、過表達TrkB-T1對食管癌細(xì)胞遷移侵襲及EMT的影響，揭示其機制與miR-186-5p靶向TrkB-T1相關(guān)，為食管癌的治療提供新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常食管上皮細(xì)胞HEEC、食管癌細(xì)胞ECA109、TE1、KYSE150均購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室購自美國Coming公司；PVDF膜購自德國羅氏診斷有限公司；SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術(shù)公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將人正常食管上皮細(xì)胞HEEC、食管癌細(xì)胞ECA109、TE1、KYSE150，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例更換培養(yǎng)基，傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組:將miR-NC、miR-186-5p mimics、si-NC、si-TrkB-T1、miR-186-5p+pcDNA、miR-186-5p+pcDNA-LRIGl按照脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000說明書操作步驟要求轉(zhuǎn)染至EJ細(xì)胞，分別標(biāo)記為miR-NC組、miR-186-5p組、si-NC組、si-TrkB-T1組、miR-186-5p+pcDNA組、miR-186-5p+pcDNA-LRIGl組，轉(zhuǎn)染48 h后，用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)試驗。

1.2.3 qRT-PCR實驗檢測細(xì)胞中miR-186-5p、TrkB-T1的mRNA表達:取適量對數(shù)生長期1.2.2各組細(xì)胞，遵照RNA抽提試劑盒說明書要求操作提取RNA，進行定量，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書操作進行miR-186-5p、TrkB-T1檢測。用2-ΔΔCt計算miR-186-5p、TrkB-T1的表達。

1.2.4 Western blot實驗檢測細(xì)胞中TrkB-T1、Twist、N-cadherin、E-cadherin的蛋白表達:收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加發(fā)光液，曝光。

1.2.5 Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移侵襲:將細(xì)胞以106個/孔接種于細(xì)胞6孔板，培養(yǎng)至融合度75%時，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。調(diào)整細(xì)胞密度至105個/ml，取100 μl加入上室內(nèi)，600 μl含血清的培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)過夜。取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，PBS洗滌，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細(xì)胞數(shù)，隨機選5個視野計數(shù)，取平均值。將Transwell小室上表面鋪適量厚度的基質(zhì)膠，然后按照上述操作方法操作。最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細(xì)胞。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細(xì)胞的熒光活性:采用在線靶基因預(yù)測庫targetscan(http://www.targetscan.org/)檢測到miR-186-5p與TrkB-T1 3’UTR存在結(jié)合位點，為驗證這一預(yù)測，構(gòu)建TrkB-T1 3’UTR-WT(含TrkB-T1 3’UTR片段)和TrkB-T1 3’UTR-MUT(含TrkB-T1 3’UTR片段突變體)的熒光素酶報告載體，采用LipofectamineTM2000分別將TrkB-T1 3’UTR-WT和TrkB-T1 3’UTR-MUT與miR-186-5p、miR-NC共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術(shù)手冊操作，記錄螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶激發(fā)值，以二者的比值評價TrkB-T1基因的熒光活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-186-5p、TrkB-T1在食管癌細(xì)胞中的表達 與HEEC比較，食管癌細(xì)胞ECA109、TE1、KYSE150中miR-186-5p的mRNA表達顯著降低，TrkB-T1的mRNA和蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 miR-186-5p、TrkB-T1在食管癌細(xì)胞中的表達

圖1 TrkB-T1在食管癌細(xì)胞中的蛋白表達

2.2 過表達miR-186-5p對食管癌細(xì)胞遷移侵襲及EMT相關(guān)蛋白表達的影響 與miR-NC組比較，miR-186-5p組ECA109細(xì)胞中miR-186-5p表達顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低，Twist、N-cadherin蛋白表達顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 過表達miR-186-5p對食管癌細(xì)胞遷移侵襲及EMT相關(guān)蛋白表達的影響

圖2 過表達miR-186-5p的食管癌細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達

2.3 miR-186-5p靶向TrkB-T1 采用target scan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-186-5p與TrkB-T1 3’UTR存在結(jié)合位點；雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-186-5p組WT-TrkB-T1細(xì)胞中熒光活性顯著降低，MUT-TrkB-T1細(xì)胞中熒光活性不受影響；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-186-5p組細(xì)胞中TrkB-T1表達顯著升高，與miR-NC組比較，miR-186-5p組細(xì)胞中TrkB-T1表達顯著降低(P<0.05)。見表3、4，圖3、4。

表3 雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果

表4 miR-186-5p對TrkB-T1蛋白表達的影響

圖3 miR-186-5p與TrkB-T1的靶向結(jié)合位點

圖4 TrkB-T1蛋白的表達

2.4 敲減TrkB-T1對食管癌細(xì)胞遷移侵襲及EMT相關(guān)蛋白表達的影響 與si-NC組比較，si-TrkB-T1組ECA109細(xì)胞中TrkB-T1表達顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低，Twist、N-cadherin蛋白表達顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖5，表5。

表5 敲減TrkB-T1對TrkB-T1細(xì)胞遷移侵襲的影響

圖5 敲減TrkB-T1的食管癌細(xì)胞中TrkB-T1蛋白表達

2.5 過表達TrkB-T1逆轉(zhuǎn)miR-186-5p對食管癌細(xì)胞遷移侵襲、EMT的抑制作用 與miR-186-5p+pc DNA組比較，miR-186-5p+pc DNA-TrkB-T1組ECA109細(xì)胞中miR-186-5p表達顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高，Twist、N-cadherin蛋白表達顯著升高，E-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表6，圖6。

表6 過表達TrkB-T1逆轉(zhuǎn)miR-186-5p對食管癌細(xì)胞遷移侵襲、EMT的抑制作用

圖6 過表達TrkB-T1逆轉(zhuǎn)miR-186-5p對食管癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

miRNA通過與靶基因的3’UTR發(fā)生特異性結(jié)合，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，進而發(fā)揮調(diào)控作用[8]。miR-186在人類的多種癌癥中均表現(xiàn)出失調(diào)，其中包括食管癌。Liu等[9]在食管癌的研究中通過高通量miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，miR-186為表達異常降低的miRNA之一。Yan等[10]在研究中也有報道，miR-186是食管癌中差異最顯著的miRNA之一。He等[11]在研究中報道，miR-186是食管癌中的低表達與癌癥的分期、分化程度及淋巴轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性，并且過表達miR-186可抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲，促進凋亡，其機制與靶向SKP2有關(guān)，提示miR-186具有作為食管癌治療的潛在靶點。本研究采用qRT-PCR檢測了食管癌細(xì)胞中 miR-186-5p的mRNA的表達發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p表達異常降低，這與前人的研究結(jié)果均相一致，再次驗證了miR-186-5p在食管癌中的異常下調(diào)；進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-186-5p可抑制食管癌細(xì)胞的遷移侵襲，下調(diào)促EMT標(biāo)志蛋白Twist、N-cadherin的表達，上調(diào)抑EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin，證實了miR-186-5p抑制食管癌細(xì)胞遷移侵襲的功能，其機制可能與抑制細(xì)胞的EMT化密切相關(guān)；深入研究，通過生物信息學(xué)預(yù)測、雙熒光素酶報告基因檢測實驗、Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p可靶向負(fù)調(diào)控TrkB-T1的表達，推測miR-186-5p在食管癌中的功能可能與TrkB-T1的表達具有相關(guān)性。

TrkB-T1是TrkB-T1的可變剪接轉(zhuǎn)錄變體，具有獨特的COOH-末端12-氨基酸序列，具有酪氨酸激酶的活性，主要位于細(xì)胞質(zhì)[12]。Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)，TrkB-T1在所有鱗狀細(xì)胞癌中的表達均出現(xiàn)明顯的上調(diào)，但是這種高表達與喉鱗癌的存活率低呈負(fù)相關(guān)，與肺癌的存活率呈正相關(guān)，其機制與調(diào)節(jié)hedgehog基因通路相關(guān)蛋白及Nfe2l2應(yīng)答、Tp63、Keap1和p62/SQSTM1蛋白具有顯著的相關(guān)性。Kupferman等[14]在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，用BDNF(TrkB的配體)體外刺激上調(diào)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并且TrkB的瞬時和穩(wěn)定抑制導(dǎo)致組成型和配體介導(dǎo)的遷移和侵襲的顯著消除。此外，強制性過表達TrkB導(dǎo)致EMT的分子介質(zhì)表達的改變，如E-鈣粘蛋白的下調(diào)和Twist的上調(diào)，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌小鼠模型顯示TrkB的下調(diào)抑制腫瘤生長，暗示TrkB參與EMT和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的侵襲，并且與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中TrkB的體內(nèi)過表達相關(guān)。本研究通過qRT-PCR、Western blot實驗檢測了食管癌細(xì)胞中TrkB-T1的mRNA和蛋白表達發(fā)現(xiàn)，TrkB-T1異常升高，這與Zhou[13]的實驗結(jié)果相呼應(yīng)；進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲減TrkB-T1可抑制食管癌細(xì)胞的遷移侵襲，下調(diào)Twist、N-cadherin，上調(diào)E-cadherin，這揭示了TrkB-T1在食管癌中的促進轉(zhuǎn)移的功能，為深入探索TrkB-T1在食管癌的中功能提供新的參考；重要的是過表達TrkB-T1可逆轉(zhuǎn)miR-186-5p對食管癌細(xì)胞的遷移侵襲和EMT的抑制作用，說明不僅miR-186-5p可靶向調(diào)控TrkB-T1，相反，TrkB-T1也可負(fù)向調(diào)控miR-186-5p在食管癌細(xì)胞中的表達和功能。

綜上所述，miR-186-5p抑制食管癌細(xì)胞遷移侵襲和EMT，其機制與靶向負(fù)調(diào)控TrkB-T1有關(guān)，為食管癌的治療提供新的作用靶點。