基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析大電導(dǎo)鈣激活鉀通道基因敲除后大鼠胰腺基因表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化

盧迪 李苗苗 郝建宇

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100020

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large conductance calcium-activated potassium channels，BKCa)是鉀離子通道中的一員，在機(jī)體內(nèi)廣泛分布，已被證實(shí)參與許多重要的生物學(xué)活動(dòng)，如動(dòng)作電位復(fù)極化、神經(jīng)元興奮性傳導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、激素的分泌、維持平滑肌組織的張力等[1]。BKCa與高血壓、心力衰竭、糖尿病等多種疾病相關(guān)[2-4]，但其在胰腺相關(guān)疾病中的研究較少，目前僅有少量研究報(bào)道BKCa對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定影響，但并未深入探討相關(guān)的分子機(jī)制[5-6]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一種高通量測(cè)序技術(shù)，以基因功能和結(jié)構(gòu)研究為基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，準(zhǔn)確獲得某一物種特定細(xì)胞、組織或器官在特定狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，用于研究差異基因表達(dá)、基因功能和結(jié)構(gòu)、新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)以及預(yù)測(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用等，具有通量高、可重復(fù)性高、檢測(cè)范圍寬、定量準(zhǔn)等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析BKCa基因敲除大鼠胰腺的基因表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化，以期為胰腺疾病BKCa的研究提供理論依據(jù)。

材料與方法

3只BKCa基因敲除成年雌性SD大鼠由首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系王偉教授饋贈(zèng)。該模型由南京大學(xué)模型動(dòng)物研究中心采用CRISPR/Cas9法制備，通過雜合的雌雄繁殖對(duì)維持傳代。3只野生型成年雌性SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，作為野生組。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：溫度(22±2)℃，濕度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，自由接觸飼料和水。

大鼠取胰腺前12 h禁食，自由飲水。采用戊巴比妥溶液4 mg/100 g行腹腔內(nèi)麻醉，備皮、消毒后取腹正中線切口入腹，從肝右葉下后方提出十二指腸，可見十二指腸包繞的呈片狀粉紅色的胰腺組織，將胰腺組織全部提出，浸泡入RNA later溶液中備用。

用Trizol(Invitrogen公司)提取胰腺組織總RNA，用Agilent 2100 BioAnalyzer分析儀(Agilent Technologies公司)和Qubit Fluorometer熒光儀(Invitrogen公司)評(píng)估RNA完整性(RNA integrity number, RIN)，即RIN>7.0且28S/18S>1.8。所有樣本均建立一個(gè)獨(dú)立的cDNA文庫進(jìn)行單獨(dú)測(cè)序。應(yīng)用美國(guó)Illumina生物技術(shù)公司的樣品制備試劑盒構(gòu)建cDNA文庫，按說明書操作。隨后使用Agilent 2000儀(Agilent Technologies公司)進(jìn)行庫檢，庫檢合格后利用HiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái)(Illumina公司)對(duì)文庫進(jìn)行測(cè)序，并使用Fast QC(Version 0.11.5)軟件對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，然后使用NGSQC(v0.4)軟件過濾，去除接頭、剪切末端低質(zhì)量堿基等。最后使用HISAT2軟件對(duì)過濾后的數(shù)據(jù)與野生型SD大鼠的參考基因組進(jìn)行比對(duì)。

利用差異基因分析軟件DEGseq2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P≤0.05且|log2fold change|≥1.0為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)，并對(duì)具有相同或相似表達(dá)行為的DEGs做層次聚類分析。

通過檢索Ensembl數(shù)據(jù)庫、美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(National Center for Biotechnology Information, NCBI)、通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(UniProt Knowledge base, Uniprot)、基因本體數(shù)據(jù)庫(gene ontology, GO)、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)，使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件比對(duì)，確定DEGs的功能注釋。選取最佳匹配項(xiàng)來標(biāo)注DEGs。最后使用Go seq R包和KOBAS 3.0軟件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)對(duì)檢測(cè)到的DEGs進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。P值或q值<0.05認(rèn)為是顯著富集。

使用SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒(美國(guó)Life公司)將BKCa敲除組大鼠和野生組大鼠胰腺組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，隨后使用SYBR Green試劑盒(美國(guó)Life公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參照。因?yàn)镻I3K/Akt信號(hào)通路在胰腺的生理及疾病狀態(tài)下的功能十分重要，故驗(yàn)證該通路內(nèi)的DEGs。PI3K/Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的引物序列見表1[7-11]。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。用公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列

結(jié) 果

提取的總RNA 的A260/280值均在1.8～2.1之間，濃度均在500 mg/L以上。各樣本Clean Data中Q30堿基百分比均≥90%，將Clean Data與參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，各樣本的reads與參考基因組的比對(duì)率均≥ 70%，樣本質(zhì)量合格。

BKCa敲除組和野生組大鼠胰腺樣本共檢測(cè)到18 258個(gè)基因，這些基因在NCBI、Uniprot、KEGG、GO、Ensembl中的注釋數(shù)量分別為15 872、15 576、5754、10 495、18 258個(gè)。通過GO數(shù)據(jù)庫分析表明這些基因富集在4 870個(gè)GO條目?jī)?nèi)，其中3 734個(gè)涉及生物學(xué)過程，471個(gè)涉及細(xì)胞組分，665個(gè)涉及分子功能；通過KEGG數(shù)據(jù)庫分析表明這些基因富集在細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝、機(jī)體系統(tǒng)等生物學(xué)過程中。

經(jīng)DESeq2軟件篩選出348個(gè)DEGs，其中200個(gè)在BKCa敲除組中高表達(dá)，148個(gè)低表達(dá)(圖1)。聚類分析后發(fā)現(xiàn)BKCa敲除組和野生組之間DEGs的區(qū)分明顯(圖2)。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖

圖2 BKCa敲除組(1)和野生組(2)差異表達(dá)基因聚類熱圖

348個(gè)DEGs中， GO數(shù)據(jù)庫顯示214個(gè)富集在56個(gè)GO條目?jī)?nèi)，其中24個(gè)涉及生物學(xué)過程，18個(gè)涉及細(xì)胞組分，14個(gè)涉及分子功能(圖3)。

圖3 差異表達(dá)基因在GO數(shù)據(jù)庫中的注釋情況

KEGG數(shù)據(jù)庫顯示348個(gè)DEGs在細(xì)胞信號(hào)通路等條目中有較多的注釋(圖4)，富集前3位的通路分別為感覺系統(tǒng)相關(guān)通路、蛋白消化吸收相關(guān)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路(圖5)。

圖4 差異表達(dá)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中的注釋情況

圖5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

對(duì)富集到PI3K/Akt的15個(gè)DEGs進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示表達(dá)上調(diào)的基因包括Lama2、Rxra、Itga3、Cdkn1a、Hsp90ab1、Hsp90aa1、Il6r、Foxo3a、Thbs1、Kit、Col4a1、Lamc1、Col1a2；表達(dá)下調(diào)的基因包括Ppp、Pik3r1。

RT-PCR對(duì)表達(dá)上調(diào)的前5位基因(Hsp90ab1、Hsp90aa1、Foxo3a、Thbs1、Col1a2)和表達(dá)下調(diào)的2種基因(Ppp、Pik3r1)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示BKCa敲除組胰腺Hsp90ab1、Hsp90aa1、Foxo3a、Col1a2基因的表達(dá)顯著高于野生組，而Thbs1、Pik3r1和Ppp基因表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 胰腺組織PI3K/Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)

討 論

BKCa在胰腺中的功能尚不十分清楚，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)KCa基因敲除大鼠及野生型大鼠的胰腺進(jìn)行基因表達(dá)分析，隨后通過基因富集分析發(fā)現(xiàn)BKCa可能與多條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如PI3K/Akt信號(hào)通路、Estrogen信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路等存在密切的關(guān)系。

本研究富集到PI3K/Akt信號(hào)通路的差異基因數(shù)量最多，達(dá)15個(gè)。對(duì)其中7個(gè)基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)4個(gè)差異基因表達(dá)情況與測(cè)序結(jié)果相符，這可能是由于二代測(cè)序和RT-PCR兩種方法的靈敏度和特異度的差異所導(dǎo)致，通常以RT-PCR等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的結(jié)果為準(zhǔn)。

本研究結(jié)果顯示，BKCa敲除后Foxo3a表達(dá)上調(diào)十分顯著，而Pik3r1表達(dá)無明顯變化(Pik3r1是編輯PI3K重要亞基的基因)。既往文獻(xiàn)提示Foxo3a在胰腺癌中主要發(fā)揮抑癌作用[12]，也有研究指出Foxo3a可能在肝癌[13]、胃癌[14]、結(jié)直腸癌[15]等消化系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。而Foxo3a最常受到PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控，活化的PI3K/Akt會(huì)通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致Foxo3a在細(xì)胞內(nèi)定位的改變或降解，從而促進(jìn)癌癥的進(jìn)展[16]。本研究結(jié)果提示，BKCa可能在PI3K/Akt的下游抑制Foxo3a的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮促癌作用，這一假說與BKCa在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的研究結(jié)果相吻合[5]。但BKCa影響Foxo3a表達(dá)的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

除Foxo3a外，Hsp90相關(guān)基因在BKCa敲除大鼠胰腺中也被證實(shí)為表達(dá)顯著上調(diào)。而Hsp90通常被認(rèn)為會(huì)促進(jìn)癌癥進(jìn)展，且已被證實(shí)與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[17]。本研究中BKCa基因敲除后Hsp90表達(dá)上調(diào)，提示BKCa可能對(duì)Hsp90的表達(dá)起抑制作用，從而推測(cè)BKCa可能發(fā)揮抑癌作用，與前述文獻(xiàn)得出的結(jié)論相反，這可能是由于本研究的局限性所導(dǎo)致的，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄組測(cè)序僅僅是針對(duì)基因表達(dá)量的分析，部分基因及其轉(zhuǎn)錄、翻譯的蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí)可能并不依賴表達(dá)量，而是依賴磷酸化、甲基化等方式。本課題組下一步擬從利用BKCa抑制劑、激動(dòng)劑以及膜片鉗等技術(shù)全面分析BKCa在胰腺細(xì)胞中的作用，以期為今后的臨床和基礎(chǔ)研究提供幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突