基于“成分-靶點(diǎn)-通路”的枸杞子調(diào)控年齡相關(guān)性黃斑變性作用機(jī)制研究

鄭慧麗，曹 程，王穎異，陳晨凱，張浩寬，張 芳，朱 悅，段金廒

基于“成分-靶點(diǎn)-通路”的枸杞子調(diào)控年齡相關(guān)性黃斑變性作用機(jī)制研究

鄭慧麗1, 2, 3，曹 程1, 2, 3，王穎異1, 2, 3，陳晨凱1, 2, 3，張浩寬1, 2, 3，張 芳1, 2, 3，朱 悅1, 2, 3*，段金廒1, 2, 3*

1. 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程中心，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023 3. 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討枸杞子改善年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）的活性成分及作用機(jī)制。以檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和查閱文獻(xiàn)獲得的枸杞子潛在活性成分為研究對(duì)象，通過(guò)Swiss Target Prediction平臺(tái)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、DDT數(shù)據(jù)庫(kù)和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)活性成分的潛在靶點(diǎn)；應(yīng)用Metascape平臺(tái)對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析；運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)和“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)；考察枸杞子不同提取部位對(duì)碘酸鈉誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19活力的影響，以及對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2中炎癥因子表達(dá)的影響。枸杞子中的88個(gè)活性成分通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）等靶點(diǎn)，參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，影響晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、IL-17、TNF等信號(hào)通路發(fā)揮改善AMD的作用。枸杞子95%乙醇提取部位能夠顯著提高碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活力（＜0.001），并顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平（＜0.05、0.01、0.001）。枸杞子中多種成分具有影響AMD相關(guān)靶點(diǎn)的潛在作用，枸杞子能夠通過(guò)改善氧化損傷、抑制炎癥反應(yīng)治療AMD，為后續(xù)深入研究枸杞子中不同活性成分調(diào)節(jié)AMD的作用機(jī)制提供依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；枸杞子；年齡相關(guān)性黃斑變性；氧化應(yīng)激；炎癥反應(yīng)；95%乙醇提取部位

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）多發(fā)于60歲以上的老人，主要影響視網(wǎng)膜中央凹黃斑區(qū)域，可導(dǎo)致永久性視力障礙或失明，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。對(duì)AMD患病率的最新薈萃分析顯示[1]，45～85歲人群AMD的患病率約為8.7%，其中早期患病率約為8%，晚期患病率約為0.4%。隨著人口老齡化加劇，預(yù)計(jì)2040年全球受AMD影響的人數(shù)將增加至2.88億[2-3]。作用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的藥物可降低失明和嚴(yán)重視力損害[4-5]，但國(guó)際上尚無(wú)治療干性AMD的藥物。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AMD屬于“視直為曲”“視瞻昏渺”“暴盲”的范疇?！鹅`樞·大惑論》中“五臟六腑之精氣皆上注于目而為之精”，明確了眼睛與臟腑之間的關(guān)系。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝腎虧虛、脾氣虛弱是AMD的基本病機(jī)，滋補(bǔ)肝腎、活血化瘀、益精明目AMD的基本治法[6-7]。枸杞子為茄科植物寧夏枸杞L.的干燥成熟果實(shí)，《本草綱目》中記載“枸杞子除邪熱、明目輕身，可用于虛勞虧損、眩暈耳鳴、內(nèi)熱消渴、目眩不明等病癥”。枸杞子中化學(xué)成分較為豐富，主要包括多糖、糖脂、甾醇及固醇類(lèi)、黃酮類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素、酰胺類(lèi)、生物堿、氨基酸、脂肪酸、萜類(lèi)等成分。研究表明，枸杞子具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)等作用[8-9]，為治療AMD的常用代表中藥[10]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)和計(jì)算機(jī)分析技術(shù)，通過(guò)多層次闡明藥物的作用機(jī)制，具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，與中醫(yī)藥治療的整體性和協(xié)同性相契合[11-12]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，從整體揭示枸杞子對(duì)AMD的干預(yù)作用及其機(jī)制，為后續(xù)深入研究枸杞子中不同活性成分調(diào)節(jié)AMD的作用機(jī)制以及抗AMD藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性成分的收集

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://lsp. nwu.edu.cn/tcmsp.php）[13]以口服生物利用度≥30%、類(lèi)藥性≥0.18為篩選條件，結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)調(diào)研獲取枸杞子活性成分信息，通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)和ChemDraw 18.0軟件獲得活性成分的分子結(jié)構(gòu)。

1.2 靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選

以篩選所得的活性成分為研究對(duì)象，通過(guò)TCMSP、Swiss Target Prediction平臺(tái)（http://www. swisstargetprediction.ch/）[14]預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。以“AMD”“濕性AMD”“新生血管性AMD”“濕性AMD”“地圖樣萎縮”為疾病關(guān)鍵詞，通過(guò)OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www. genecards.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和DurgBank（https://www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，并與枸杞子靶點(diǎn)取交集，獲得枸杞子改善AMD的潛在靶點(diǎn)。

1.3 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了明確枸杞子活性成分與AMD靶點(diǎn)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，取二者靶點(diǎn)的交集，通過(guò)STRING（https://string-db.org）數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，將生物種類(lèi)設(shè)定為人類(lèi)，最小相互作用閾值設(shè)定為0.4。通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件中MCODE和Network Analyzer功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類(lèi)分析和拓?fù)浞治觯@得枸杞子調(diào)控AMD的核心靶點(diǎn)。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

將枸杞子改善AMD的靶點(diǎn)輸入Metascape平臺(tái)（https//www.metascape.org），將生物種類(lèi)設(shè)定為人類(lèi)，設(shè)置＜0.001，進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，保存數(shù)據(jù)并進(jìn)行可視化處理。

1.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將枸杞子活性成分、潛在靶點(diǎn)與疾病通路富集分析結(jié)果進(jìn)行映射，導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.6.1 細(xì)胞株 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19和小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2均購(gòu)自上海賽百慷公司。

1.6.2 藥物及提取物制備 枸杞子（批號(hào)1612102）購(gòu)自寧夏明德中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心段金廒教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞L.的干燥成熟果實(shí)。按圖1提取流程制備得到枸杞子水提取液（ST）、多糖部位（DT）、水部位（SBW）、30%乙醇部位、70%乙醇部位、95%乙醇部位、水提后醇提取液（SC）和色素部位（SS）。各樣品經(jīng)離心濃縮或凍干后，稱取10 mg溶于DMSO配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 試劑 DMEM/F-12培養(yǎng)基（批號(hào)10092011）、MEM-Eagle培養(yǎng)基（批號(hào)12120005）購(gòu)自Corning公司；0.25%胰蛋白酶（批號(hào)2038152）、胎牛血清（批號(hào)2177370）、青霉素-鏈霉素-制霉素溶液（批號(hào)2012208）購(gòu)自Gibco公司；噻唑藍(lán)溴化四唑（批號(hào)I1810035）、碘酸鈉（批號(hào)E1802068）購(gòu)自Aladdin公司；脂多糖（批號(hào)12180309）購(gòu)自Sigma公司；Trizol（批號(hào)176908）購(gòu)自Life Technology公司；FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒（批號(hào)S8125）購(gòu)自TianGen公司、Green qPCR SuperMix檢測(cè)試劑盒（批號(hào)N41217）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由上海英濰捷基公司合成。

1.6.4 儀器 1300 series A2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司）；多功能酶標(biāo)儀（PerkinElmer公司）；QuantStudio 5熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)AB公司）。

1.6.5 枸杞子提取物對(duì)碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活力的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞以4×104個(gè)/mL接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、枸杞子不同部位藥物（1、3、10 μg/mL）組，模型組和各給藥組加入碘酸鈉（1.3 mg/mL），各給藥組另加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的10% FBS DMEM/F-12培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT（500 μg/mL）溶液，孵育4 h，棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，于37 ℃搖床孵育30 min，于570 nm處檢測(cè)吸光度（）值。

圖1 枸杞子提取物制備流程

1.6.6 枸杞子提取物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響 將融合度為70%的BV2細(xì)胞以4×105個(gè)/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、枸杞子不同部位藥物（1、3、10 μg/mL）組，模型組和各給藥組加入脂多糖（1 μg/mL），各給藥組另加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 h。以磷酸鹽緩沖液洗滌2遍后，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)制備cDNA，進(jìn)行qRT-PCR。引物序列：IL-6上游引物為5’-CGTCACACATCCCGTCAG-3’，下游引物為5’-GGATGAGGGATGCCAGTTG-3’；IL-1β上游引物為5’-TGCTGAATCCAAGCCTCTG-3’，下游引物為5’-TTTAATGCAACTTCCCTT-3’；TNF-α上游引物為5’-GGATCCTGCACATGGGTAC-3’，下游引物為5’-CTGTTCCTCCAGGTCGATG-3’；GAPDH上游引物為5’-GACGCTGCTCATCCCACTA-3’，下游引物為5’-CCACCTGGTCCTCATCGTT-3’。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 枸杞子活性成分的篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到枸杞子活性成分36個(gè)，刪除重復(fù)值后共35個(gè)。通過(guò)檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)得到枸杞子活性成分265個(gè)[15-23]，合并2次檢索信息，刪除重復(fù)值，共獲得枸杞子活性成分287個(gè)，其具體類(lèi)型及分布見(jiàn)圖2。

2.2 潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將上述活性成分的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction平臺(tái)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，共獲得靶點(diǎn)1133個(gè)。可能性值越高表明該靶點(diǎn)可信度越高，根據(jù)靶點(diǎn)的可信度，取可能性≥0.5的126個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行下一步分析。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得194個(gè)靶點(diǎn)，合并2次檢索信息，刪除重復(fù)值，共獲得枸杞子靶點(diǎn)444個(gè)。從Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得AMD靶點(diǎn)3021個(gè)，疾病靶點(diǎn)度值最大值為156.59，最小值為0.23，取其2倍中位數(shù)，設(shè)定相關(guān)度大于6.47的靶點(diǎn)為AMD的潛在靶點(diǎn)。結(jié)合OMIM、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)靶點(diǎn)，整合并刪除重復(fù)值，經(jīng)Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范化后得到553個(gè)疾病靶點(diǎn)。利用Venn作圖取交集，如圖3所示，得到80個(gè)枸杞子改善AMD的潛在靶點(diǎn)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將從String數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的靶點(diǎn)PPI圖導(dǎo)入Cytoscape軟件，通過(guò)MCODE聚類(lèi)分析功能得到核心子網(wǎng)絡(luò)，如圖4所示，靶點(diǎn)度值越大，形狀越大，表明靶點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)中其他靶點(diǎn)連接越緊密。VEGFA、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、IL-6、TNF、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase- 9，MMP-9）等排名靠前的靶點(diǎn)為枸杞子改善AMD的核心靶點(diǎn)。

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析

2.4.1 GO分析 利用Matescape平臺(tái)對(duì)枸杞子調(diào)控AMD的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，枸杞子主要通過(guò)參與調(diào)節(jié)對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路等1816個(gè)生物過(guò)程發(fā)揮改善AMD的作用，將＜0.001排名前10的條目運(yùn)用R語(yǔ)言繪制氣泡圖，如圖5所示。

2.4.2 KEGG分析 利用Matescape平臺(tái)對(duì)枸杞子調(diào)控AMD的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析，枸杞子主要通過(guò)參與調(diào)節(jié)流式剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）信號(hào)通路、癌癥通路、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路等135個(gè)通路發(fā)揮改善AMD的作用，將＜0.001排名前10的條目運(yùn)用R語(yǔ)言繪制氣泡圖，如圖6所示。

2.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)CytoScape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，如圖7所示，該網(wǎng)絡(luò)共有180個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括1種藥材、88個(gè)活性成分、80個(gè)靶點(diǎn)、10條通路、1個(gè)疾?。?。拓?fù)浞治鼋Y(jié)果如表1所示，槲皮素、楊梅素、谷氨酸、β-胡蘿卜素、桑色素等節(jié)點(diǎn)度值排名靠前，可能為枸杞子中的主要活性成分。

2.6 枸杞子提取物對(duì)碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活力的影響

如圖8所示，與模型組比較，各質(zhì)量濃度的枸杞子95%乙醇部位均可顯著升高ARPE-19細(xì)胞活力（＜0.001），70%乙醇部位次之（＜0.05、0.01、0.001），此外，ST低劑量組和SC中劑量組可顯著提高ARPE-19細(xì)胞活力（＜0.05、0.01），表明枸杞子95%和70%乙醇部位對(duì)碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用。

圖2 枸杞子中潛在活性成分類(lèi)型及其分布

圖3 枸杞子成分與AMD靶點(diǎn)的韋恩圖

圖4 枸杞子成分與AMD靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG富集分析

綠色三角形代表藥物；藍(lán)色圓圈代表枸杞子活性成分；綠色菱形代表靶點(diǎn)；紅色箭頭代表通路；藍(lán)色三角形代表疾病

表1 枸杞子活性成分拓?fù)湫畔?/p>

續(xù)表1

編號(hào)名稱化學(xué)式度值 GQ60zeaxanthin monopalmitate C56H86O36 GQ61zeaxanthin dipalmitateC72H116O46 GQ62zeaxanthin monomyristateC54H82O32 GQ63zeaxanthin myristate palmitateC70H112O46 GQ64β-cryptoxanthin palmitateC56H82O26 GQ69tetraterpenyl hexaarabinoside C70H118O2611 GQ70violaxanthin dipalmitateC72H116O64 GQ71aspartic acidC4H7NO44 GQ72L-threonineC4H9NO35 GQ73serineC3H7NO36 GQ74L-glutamic acidC5H9NO414 GQ75alanineC3H7NO27 GQ76valineC5H11NO24 GQ77methionineC5H11NO2S2 GQ78isoleucineC6H13NO23 GQ79L-leucineC6H13NO23 GQ80tyrosineC9H11NO35 GQ81L-arginineC6H14N4O22 GQ82tryptophanC11H12N2O22 GQ83prolineC5H9NO22 GQ84γ-aminobutyric acidC4H9NO24 GQ85L-ornithineC5H12N2O22 GQ86nicotinic acidC6H5NO24 GQ87adenineC5H5N52 GQ88α-tocopherolC29H50O22

與對(duì)照組比較：###＜0.001；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001

###< 0.001control group;*< 0.05**< 0.01***< 0.001model group

2.7 枸杞子提取物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

如圖9所示，與對(duì)照組比較，模型組BV2細(xì)胞中IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，ST中、高劑量組及SC低劑量組及SS中、高劑量組、各劑量SBW組及30%乙醇部位低、中劑量組及70%乙醇部位低、中劑量組及95%乙醇部位各劑量組均能顯著下調(diào)BV2細(xì)胞中IL-6 mRNA水平（＜0.05、0.01、0.001）；ST高劑量組、SC低劑量組、SS高劑量組、SBW高劑量組及70%乙醇部位中、高劑量組及95%乙醇部位中、高劑量組均能顯著下調(diào)BV2細(xì)胞中IL-1β mRNA水平（＜0.05、0.01、0.001）；ST低、高劑量組及SC各劑量組、DT高劑量組、SS高劑量組及SBW中、高劑量組及30%乙醇部位中劑量組及70%乙醇部位低、中劑量組及95%乙醇部位各劑量組均能顯著下調(diào)BV2細(xì)胞中TNF-αmRNA水平（＜0.05、0.01、0.001）。

3 討論

研究表明，部分患者對(duì)臨床用于治療濕性AMD的抗VEGF藥物無(wú)應(yīng)答反應(yīng)，且患者可能由于長(zhǎng)期抑制視網(wǎng)膜血管生成，導(dǎo)致萎縮性視網(wǎng)膜病變加重而喪失視力[24]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AMD早期以臟腑精氣虧虛、目失濡養(yǎng)為主，后期出現(xiàn)痰、濕、熱、瘀，其病理機(jī)制與肝腎虧虛、脾氣虛弱有關(guān)，調(diào)理臟腑、氣血津液盈虧和脈絡(luò)論治對(duì)AMD具有一定療效[25]。枸杞子作為傳統(tǒng)的滋補(bǔ)肝腎、益精明目中藥，用于治療血虛萎黃、目昏不明等病癥[26]?；谥嗅t(yī)傳承輔助平臺(tái)的AMD方劑中用藥頻次分析，發(fā)現(xiàn)枸杞子為使用頻率排名前3的中藥之一[10]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性與系統(tǒng)性，對(duì)枸杞子治療AMD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制進(jìn)行挖掘，以期為枸杞子的開(kāi)發(fā)和AMD臨床藥物的研發(fā)提供參考。

與對(duì)照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

AMD是一種以慢性炎癥、氧化應(yīng)激、衰老為特征的退行性疾病。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞RPE衰老過(guò)程中，由活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）引起的一系列進(jìn)行性損傷，導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，引起細(xì)胞功能異常，RPE細(xì)胞丟失為干性AMD的特征病理表現(xiàn)[27]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為視網(wǎng)膜上固有巨噬細(xì)胞，可以觸發(fā)炎癥反應(yīng)和血管生成，在視網(wǎng)膜變性的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[28]。碘酸鈉作為一種氧化性化合物，能夠誘導(dǎo)RPE細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生[29]，被廣泛用于RPE細(xì)胞和光感受器細(xì)胞死亡機(jī)制的研究[30]。GO功能和KEGG通路分析結(jié)果表明，枸杞子主要通過(guò)調(diào)控活性氧代謝過(guò)程、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)，影響IL-17、TNF信號(hào)通路改善AMD，本研究以碘酸鈉誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞建立氧化損傷細(xì)胞模型，以脂多糖誘導(dǎo)BV2細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型，對(duì)枸杞子改善氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)進(jìn)行初步驗(yàn)證。

由“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)可知，枸杞子中88個(gè)活性成分主要通過(guò)VEGFA、CXCL8、IL-6、TNF-α、MMP-9等靶點(diǎn)，影響AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路，發(fā)揮改善AMD的作用。VEGFA為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，參與視網(wǎng)膜新生血管的形成，為濕性AMD藥物作用的靶點(diǎn)。VEGF表達(dá)受HIF-1調(diào)控，當(dāng)視網(wǎng)膜微血管網(wǎng)進(jìn)行性損傷導(dǎo)致組織缺血，HIF-1表達(dá)上調(diào)，VEGF分泌增加，刺激新的視網(wǎng)膜前血管葉發(fā)育為特征的視網(wǎng)膜新生血管[31]。枸杞子中的甜菜堿能夠通過(guò)抑制蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）激活，下調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α和VEGF的表達(dá)抑制糖尿病患者視網(wǎng)膜新生血管形成[32]。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)失調(diào)與AMD病理中Bruch膜增厚和玻璃膜疣的積累密切相關(guān)[33]，MMP-9主要參與細(xì)胞外基質(zhì)局部蛋白水解和白細(xì)胞遷移，研究表明葉黃素和玉米黃質(zhì)可能通過(guò)下調(diào)RPE細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase，MMP-2）、金屬蛋白酶-2組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2）蛋白酶體的表達(dá)改善AMD[34]。由KEGG通路富集分析可知，枸杞子主要通過(guò)AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路抑制CXCL8、IL-6、TNF-α、IL-1β等靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)改善AMD。研究表明，枸杞子中類(lèi)胡蘿卜素成分能夠降低RPE細(xì)胞ROS、TNF-α和IL-1α的表達(dá)，改善視網(wǎng)膜炎癥[8]。Bruch膜內(nèi)膠原蛋白層和RPE基底膜之間脂質(zhì)-蛋白碎片的沉積，以及細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)度增加和AGEs的積累參與AMD病理形成[32]；枸杞多糖具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，能通過(guò)降低AGEs水平，拮抗AGEs對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，進(jìn)而保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞[35-36]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，枸杞子水提物經(jīng)大孔樹(shù)脂70%乙醇和95%乙醇洗脫部位對(duì)碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用，且95%乙醇洗脫部位可顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平，表明枸杞子可以通過(guò)抗氧化、降低視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)改善AMD。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)枸杞子改善氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)的活性進(jìn)行了初步驗(yàn)證，為后續(xù)深入研究枸杞子中不同活性成分調(diào)節(jié)AMD的作用機(jī)制提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Nowak J Z. AMD-the retinal disease with an unprecised etiopathogenesis: In search of effective therapeutics [J]., 2014, 71(6): 900-916.

[2] Jonas J B, Cheung C M G, Panda-Jonas S. Updates on the epidemiology of age-related macular degeneration [J]., 2017, 6(6): 493-497.

[3] Wong W L, Su X Y, Li X,. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis [J]., 2014, 2(2): 106-116.

[4] Bourne R R, Stevens G A, White R A,. Causes of vision loss worldwide, 1990-2010: A systematic analysis [J]., 2013, 1(6): 339-349.

[5] Dolgin E. Age-related macular degeneration foils drugmakers [J]., 2017, 35(11): 1000-1001.

[6] 李學(xué)晶, 唐由之. 年齡相關(guān)性黃斑變性的中醫(yī)認(rèn)識(shí) [J]. 中國(guó)中醫(yī)眼科雜志, 2008, 18(4): 240-242.

[7] 金明. AMD中醫(yī)病因機(jī)制認(rèn)識(shí)與現(xiàn)代研究相關(guān)性 [J]. 中國(guó)中醫(yī)眼科雜志, 2016, 26(3): 141-143.

[8] Liu L, Lao W, Ji Q S,.polysaccharides protected human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress-induced apoptosis [J]., 2015, 8(1): 11-16.

[9] 馬琳, 張蓓, 胡秀娟, 等. 枸杞多糖對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系缺糖缺氧損傷保護(hù)作用及機(jī)制研究 [J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2020, 43(4): 683-687.

[10] 秦程遙. 基于中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)的治療年齡相關(guān)性黃斑變性的組方規(guī)律分析 [D]. 南京: 南京中醫(yī)藥大學(xué), 2017.

[11] 解靜, 高杉, 李琳, 等. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥領(lǐng)域中的研究進(jìn)展與應(yīng)用策略 [J]. 中草藥, 2019, 50(10): 2257-2265.

[12] 李泮霖, 蘇薇薇. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥研究中的最新應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2016, 47(16): 2938-2942.

[13] Ru J L, Li P, Wang J N,. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines [J]., 2014, 6: 13.

[14] Daina A, Michielin O, Zoete V. Swiss Target Prediction: updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules [J]., 2019, 47(1): 357-364.

[15] Jung K, Chin Y W, Kim Y C,. Potentially hepatoprotective glycolipid constituents offruits [J]., 2005, 28(12): 1381-1385.

[16] Zhou Z Q, Xiao J, Fan H X,. Polyphenols from wolfberry and their bioactivities [J]., 2017, 214: 644-654.

[17] Li Q W, Zhang R, Zhou Z Q,. Phenylpropanoid glycosides from the fruit ofL. and their bioactivity [J]., 2019, 164: 60-66.

[18] Zhu P F, Zhao Y L, Dai Z,. Phenolic amides with immunomodulatory activity from the nonpolysaccharide fraction offruits [J]., 2020, 68(10): 3079-3087.

[19] Wang S, Suh J H, Zheng X,. Identification and quantification of potential anti-inflammatory hydroxycinnamic acid amides from wolfberry [J]., 2017, 65(2): 364-372.

[20] Yao X, Peng Y, Xu L J,. Phytochemical and biological studies ofmedicinal plants [J]., 2011, 8(6): 976-1010.

[21] Gao Z, Ali Z, Khan I A. Glycerogalactolipids from the fruit of[J]., 2008, 69(16): 2856-2861.

[22] Chen X M, You J M, Suo Y R,. Sensitive determination of taurine, γ-aminobutyric acid and ornithine in wolfberry fruit andby HPLC with fluorescence detection and online mass spectrometry identification [J]., 2015, 53(4): 492-497.

[23] 馮美玲, 王書(shū)芳, 張興賢. 枸杞子的化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥, 2013, 44(3): 265-268.

[24] Maguire M G, Martin D F, Ying G S,. Five-year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: The comparison of age-related macular degeneration treatments trials [J]., 2016, 123(8): 1751-1761.

[25] 段鈺, 劉瑞寶, 吳艷霞, 等. 年齡相關(guān)性黃斑變性的中醫(yī)治療現(xiàn)狀 [J]. 中醫(yī)眼耳鼻喉雜志, 2020, 10(1): 38-40.

[26] 王忠忠, 魯曉麗, 張自萍. 枸杞子明目作用的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)新藥雜志, 2013, 22(14): 1648-1651.

[27] Kinnunen K, Petrovski G, Moe M C,. Molecular mechanisms of retinal pigment epithelium damage and development of age-related macular degeneration [J]., 2012, 90(4): 299-309.

[28] 張鵬飛, 孫曉東. 視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞在年齡相關(guān)性黃斑變性中的免疫調(diào)節(jié)作用 [J]. 中華眼科雜志, 2016, 52(5): 386-390.

[29] Chan C M, Huang D Y, Sekar P,. Reactive oxygen species-dependent mitochondrial dynamics and autophagy confer protective effects in retinal pigment epithelial cells against sodium iodate-induced cell death [J]., 2019, 26(1): 40.

[30] Balmer J, Zulliger R, Roberti S,. Retinal cell death caused by sodium iodate involves multiple caspase- dependent and caspase-independent cell-death pathways [J]., 2015, 16(7): 15086-15103.

[31] Sene A, Chin-Yee D, Apte R S. Seeing through VEGF: Innate and adaptive immunity in pathological angiogenesis in the eye [J]., 2015, 21(1): 43-51.

[32] Kim Y G, Lim H H, Lee S H,. Betaine inhibits vascularization via suppression of Akt in the retinas of streptozotocin-induced hyperglycemic rats [J]., 2015, 12(2): 1639-1644.

[33] Hussain A A, Lee Y, Marshall J. Understanding the complexity of the matrix metalloproteinase system and its relevance to age-related diseases: Age-related macular degeneration and Alzheimer’s disease [J]., 2020, 74: 100775.

[34] 黃冰林. 枸杞醇提物及其成分葉黃素/玉米黃質(zhì)在體內(nèi)外對(duì)年齡相關(guān)性黃斑變性防治的研究 [D]. 南京: 南京中醫(yī)藥大學(xué), 2013.

[35] Zhang F, Zhang X, Guo S,. An acidic heteropolysaccharide from: Purification, characterization, neurotrophic and neuroprotective activities[J]., 2020, 249: 116894.

[36] 羅瓊, 唐韋, 周銀柱, 等. 枸杞多糖對(duì)糖基化終產(chǎn)物及視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的影響 [J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2012, 34(1): 64-67.

Machansim ofon regulating age-related macular degeneration based on “component-target-pathway”

ZHENG Hui-li1, 2, 3, CAO Cheng1, 2, 3, WANG Ying-yi1, 2, 3, CHEN Chen-kai1, 2, 3, ZHANG Hao-kuan1, 2, 3, ZHANG Fang1, 2, 3, ZHU Yue1, 2, 3, DUAN Jin-ao1, 2, 3

1. National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210023, China 3. Jiangsu Province Key Laboratory of High Technology Research, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To explore the mechanism and active components ofin treating age-related macular degeneration (AMD) based on network pharmacology and molecular experimental validation.Active compounds ofobtained from TCMSP database and literature investigation were selected as the research objects. Swiss Target Prediction platform, GeneCards, OMIM, DDT, and Drugbank database were used to screen and predict potential targets. Metascape platform was used for gene ontology and Kyoto encyclopedia of genes and genomes enrichment analysis of potential targets. The protein-protein interaction network model and “drug-ingredients-targets-pathways-disease” network were constructed by using String database and Cytoscape software. The effects of different extraction parts ofon the activity of ARPE-19 of human retinal pigment epithelial cells induced by sodium iodate and the expression of inflammatory factors in mouse microglia cell line BV2 induced by lipopolysaccharide were investigated.A total of 88 active ingredients inmight regulate vascular endothelial growth factor A (VEGFA), interleukin-8 (IL-8), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor (TNF), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and other targets. Potential targets mainly involve biological processes such as response to oxidative stress, regulation of inflammatory response, which played roles in the treatment of AMD by adjusting AGE-RAGE signaling pathway, IL-17 signaling pathway, and TNF signaling pathway. The results showed that the 95% ethanol extracts ofsignificantly improved the survival rate of ARPE-19 cells damaged by sodium iodate (< 0.001) and reduced the mRNA levels of IL-6,IL-1β, and TNF-α in BV2 cells induced by lipopolysaccharide (< 0.05, 0.01, 0.001).The results of network pharmacology showed that a variety of components inhad potential effects on AMD related targets, and preliminarily proved thatcould treat AMD by improving oxidative damage and inhibiting inflammatory response, which can provide references for further research on the mechanism of AMD regulation by different active compounds in.

network pharmacology;; age-related macular degeneration; oxidative stress; inflammatory response;95% ethanol extract

R285.5

A

0253 - 2670(2021)04 - 1039 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.017

2020-11-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81773837）

鄭慧麗（1995—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)與分析。Tel: 18851093140 E-mail: 2503567239@qq.com

段金廒，男，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源化學(xué)與資源循環(huán)利用及產(chǎn)業(yè)化。Tel: (025)85811917 E-mail: dja@njucm.edu.cn

朱 悅，男，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幑π镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (025)85811917 E-mail: zhuyue@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]