shRNA靶向干擾UL27、UL54基因?qū)SV-2復(fù)制的影響

潘曉瑜，呂延成，宋其芳，韓晉輝，朱俊訪

(1.廣東食品藥品職業(yè)學院，廣州 512000；2.遵義醫(yī)科大學 珠海校區(qū)，珠海 519041；3.暨南大學 生命科學技術(shù)學院，廣州 512000)

單純皰疹病毒-2型(HSV-2)是導(dǎo)致生殖器皰疹(Genital herpes, GH)的主要病因，GH反復(fù)發(fā)作，目前難以根治，且增加HIV感染的風險[1-2]，治療GH的主要手段是核苷類抗病毒藥物，但這類藥物難以清除潛伏感染的HSV-2。RNA干擾研究現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病毒領(lǐng)域[3-6]。HSV-2基因組約為155 kb，編碼80多種蛋白，其中HSV-2UL27和UL54基因一直都是HSV-2研究的熱點，UL27基因表達是黏附性糖蛋白(glycoprotein B, gB)，是HSV-2識別和吸附受體而感染細胞的重要組分[7]。UL54基因編碼的ICP27蛋白主要抑制宿主細胞蛋白合成，抑制病毒DNA合成及其晚期基因的表達[8-9]。根據(jù)前期研究篩選HSV-2UL27基因和UL54基因的shRNA重組質(zhì)粒表達載體[10-11]，本研究在細胞水平上進行聯(lián)合干擾HSV-2復(fù)制，為HSV-2的多基因治療提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293細胞由暨南大學抗體研究中心饋贈。Lipofectamine 2000試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。HSV-2 gB蛋白單克隆抗體、HSV-2 ICP27蛋白單克隆抗體分別為美國Santa cruz 公司和美國Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HSV-2UL27和UL54基因干擾靶位的選擇

在前期試驗中已成功構(gòu)建表達UL27和UL54序列特異性siRNA的質(zhì)粒載體且發(fā)現(xiàn)與陰性對照shRNA比較，UL27shRNA75、UL27shRNA 2265、UL54shRNA1081、UL54shRNA 1407干擾效率較高[10-11]，shRNA具體靶位序列見表1。

表1 針對HSV-2 UL27、UL54基因的shRNA序列

1.2.2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞

UL27和UL54基因的重組表達載體shRNA單干擾組UL27shRNA75、UL27shRNA2265、UL54shRNA1081和UL54shRNA1407，聯(lián)合干擾組UL27shRNA75+UL54 shRNA1081、UL27shRNA2265+UL54shRNA1081、UL27shRNA2265+UL54shRNA1407和UL27shRNA75+UL54shRNA1407，分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染操作參考文獻[12]，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 HSV-2感染HEK293細胞

各試驗組轉(zhuǎn)染重組表達載體shRNA 48 h后，接種HSV-2，每隔12 h，觀察細胞病變情況，48 h后檢測病毒滴度。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測UL27和UL54基因mRNA表達

收集各實驗組細胞，提取總RNA，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒(日本TOYOBO公司)說明書進行具體操作。各基因的引物序列如下：內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′；UL27上游引物：5′-CAAAGACGTGACCGTGTCGCAG-3′，下游引物：5′-GCGGTGGTCTCCATGTTGTTCC-3′；UL54上游引物：5′-CCAGGACCCTATCATCGGAACG-3′，下游引物：5′-AGTATTTCAATGAGACCCGCCAT-3′；反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min; 95 ℃ 變性20 s, 62 ℃ 退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算UL27基因和UL54基因mRNA相對表達量。

1.2.5 Western印跡檢測gB蛋白和ICP27蛋白表達

從收集各試驗組的細胞中提取總蛋白，測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，體積分數(shù)為5%的BSA封閉，分別加入gB單克隆抗體(1∶500)、ICP27單克隆抗體(1∶400)4 ℃過夜，羊抗鼠二抗(1∶3 000)37 ℃孵育2 h，最后化學發(fā)光，顯影定影。Western Blot條帶采用Image J軟件進行分析。

1.2.6 HSV-2病毒滴度的測定與MTT法檢測細胞存活率

在25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)HEK293細胞，當單層細胞豐度>80%時，接種2 mL HSV-2病毒懸液至單層HEK293細胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)吸附1～2 h。當細胞病變超過90%時，采用反復(fù)凍融法收集病毒檢測其子代病毒滴度，按Reed-Muench法[13]計算，能引起50%細胞發(fā)生病變的病毒液最高稀釋度(50% tissue culture infective dose, TCID50)，即病毒滴度。各試驗組細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達載體48 h后收集病毒懸液，檢測各試驗組的子代病毒懸液的TCID50。

使用 96孔培養(yǎng)板接種0.5～1×104/mL細胞懸液。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達載體后接種病毒，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后棄上清液，每孔加MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，孵育4 h，棄上清液。加入 DMSO，492 nm波長處檢測吸光度A值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞轉(zhuǎn)染效率檢測

流式細胞儀檢測質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA與轉(zhuǎn)染試劑lipofetamine2000復(fù)合物轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，綠色熒光蛋白陽性細胞占總細胞的80%，轉(zhuǎn)染效率(%)=熒光細胞數(shù)量/細胞總數(shù)×100%，即轉(zhuǎn)染效率為80%，證明轉(zhuǎn)染成功(圖1)。

(a)正常HEK293細胞；(b)轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-shRNA

2.2 實時熒光定量PCR檢測UL27和UL54mRNA的表達

qRT-PCR法檢測表明：與對照組比較，其中UL27 shRNA75+UL54shRNA1081聯(lián)合干擾組mRNA表達抑制率最高(F=419.39，P<0.05)；各聯(lián)合干擾組分別與 UL27 shRNA75組比較，差異有統(tǒng)計學意義，LSD-t分別為8.13、9.42、17.65和2.07，均P<0.05；各聯(lián)合干擾組再與UL54shRNA108組比較，差異有統(tǒng)計學意義，LSD-t分別為10.01、3.59、19.19和2.25，均P<0.05(表2)。

表2 shRNA重組質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染后UL27、UL54 mRNA表達情況

2.3 Western Blot 檢測HSV-2UL27、UL54基因的蛋白表達變化情況

1)gB蛋白表達結(jié)果：和對照組比較，各試驗組的gB蛋白表達水平差異均具有統(tǒng)計學意義(F=83.77,P<0.05)。聯(lián)合干擾組與單干擾UL27shRNA75組比較, gB蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義，LSD-t分別為8.74、3.01和3.39，均P<0.05。2)ICP27蛋白表達結(jié)果：與對照組相比，UL54shRNA1407組表達水平無明顯差異(P>0.05)，其他試驗組的ICP27蛋白表達水平差異均具有統(tǒng)計學意義(F=46.20,P<0.05)。結(jié)果表明聯(lián)合干擾組UL27shRNA75 +UL54 shRNA1081組的gB蛋白和ICP27蛋白表達下降最明顯，具體見表3和圖2。

(a)gB蛋白表達；(b)ICP27蛋白表達

2.4 子代病毒滴度和細胞存活率的檢測

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UL27 shRNA 75+UL54 shRNA1081組的子代病毒滴度降低最明顯，細胞存活率提高(表3)。

表3 各試驗組轉(zhuǎn)染后子代病毒滴度、細胞存活率、目的基因蛋白的表達檢測

3 討論與結(jié)論

大量研究表明RNA干擾已廣泛應(yīng)用于腫瘤和抗病毒的治療[14-15]，但病毒感染和復(fù)制是由其自身基因與宿主基因共同協(xié)同的結(jié)果，在病毒復(fù)制的各個階段，至少有兩個或以上功能不同的基因各自發(fā)揮不同作用，協(xié)同加強了病毒感染復(fù)制的能力。僅僅針對單個病毒基因的治療方法并不能完全抑制病毒的感染復(fù)制，多基因和多手段的聯(lián)合治療是今后抗病毒治療的主要研究方向。

HSV-2感染最常見的是引起生殖器潰瘍的疾病，UL27基因編碼的糖蛋白gB是一種對病毒-細胞融合至關(guān)重要的糖基化蛋白，通過其內(nèi)部融合環(huán)直接插入細胞膜，將病毒包膜和宿主細胞膜穩(wěn)定的吸附結(jié)合在一起，是病毒進入機體所必需的[16]。UL27基因表達的降低或缺失必定影響病毒的吸附和穿入細胞，可減弱HSV-2的感染性。UL54基因編碼多肽ICP27能直接作用于病毒mRNA在感染細胞中的表達，同時還是HSV-2裂解性復(fù)制必需的高保守蛋白，還激活DE基因和L基因的表達[17]。本研究結(jié)果表明UL27 shRNA75+UL54 shRNA1081組聯(lián)合靶向干擾效果優(yōu)于各自的單個干擾。另外，從細胞的存活率、子代的病毒滴度和目的蛋白的表達也表明UL27 shRNA75 +UL54 shRNA1081組聯(lián)合干擾比單干擾組更加有效地在HSV-2中發(fā)揮了基因沉默作用，對病毒的抑制最為明顯，證實了UL27基因和UL54基因確實在HSV-2復(fù)制過程中有著重要的作用，干擾二者基因的表達，能影響HSV-2的復(fù)制，提示兩個基因所選擇的這兩個靶位點之間可能具有相互協(xié)同效應(yīng)，能夠相互聯(lián)合增強對單一基因的抑制。其機制可能是：在病毒感染初期，抑制gB蛋白的表達病毒就不能識別相應(yīng)的受體并黏附在細胞膜上，降低了病毒的感染能力，同時還能減少病毒將遺傳物質(zhì)注入細胞。聯(lián)合干擾ICP27影響它介導(dǎo)病毒從細胞核到細胞質(zhì)的mRNAs輸出能力，可進一步抑制病毒DNA的合成。另外，聯(lián)合干擾UL27和UL54基因可調(diào)節(jié)子代病毒與感染細胞表面的相互作用[17]，從而影響HSV-2病毒感染與復(fù)制，提示聯(lián)合靶向特異性shRNA可能從不同途徑阻止HSV-2感染和復(fù)制。

本研究結(jié)果顯示聯(lián)合UL27基因靶位點75和UL54基因靶位點1081的shRNA重組表達載體比單一基因干擾可以明顯降低UL27基因和UL54基因的mRNA、蛋白表達和子代病毒滴度，提高HEK293細胞存活率。這是在細胞水平上進行的，還不能斷定相應(yīng)的shRNA在動物體內(nèi)的效應(yīng)，因此下一步將把shRNA載體用于動物模型，觀察靶向UL27基因、UL54基因在動物體內(nèi)是否能夠抑制HSV-2的復(fù)制，從而為下一步的臨床轉(zhuǎn)化提供試驗依據(jù)。