昆明漢族2 型糖尿病患者GAS6 基因rs8191974位點(diǎn)的多態(tài)性、血漿水平變化及意義

董雪娥，李會(huì)芳，王玉明，劉偉軍

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650031

2 型糖尿?。═2DM）是一種遺傳和環(huán)境因素共同作用而形成的多基因遺傳性復(fù)雜疾病，其發(fā)病的主要因素為胰島素抵抗（IR）和β細(xì)胞功能缺陷導(dǎo)致胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足和（或）作用障礙。生長(zhǎng)停滯特異性蛋白6（GAS6）屬于維生素K 依賴蛋白家族，是受體酪氨酸激酶家族TAM 受體（包括Tyro3、Axl、Mer）的共同配體。有研究表明，GAS6 可降低葡萄糖刺激的血漿胰島素分泌水平并促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖［1-2］。GAS6 基因多態(tài)性及其血漿水平與T2DM、肥胖及 IR 有相關(guān)性［3-4］，GAS6 基因 rs8191974 位點(diǎn) A等位基因及血漿GAS6 水平升高可能是T2DM 患者的保護(hù)因素［5-7］；而對(duì)中國(guó)北方漢族人群的研究顯示，GAS6基因rs8191974位點(diǎn)T等位基因是T2DM患者的保護(hù)性因素［8］?？梢?jiàn)不同種族及不同區(qū)域的T2DM 患者基因多態(tài)性分布可能存在異質(zhì)性。故本研究以昆明漢族T2DM 患者為研究對(duì)象，探討其GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)的多態(tài)性及血漿水平變化。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年2—12 月就診于本院的 T2DM 患者 352 例（T2DM 組），均符合 1999 年WHO 制訂的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，均為昆明戶籍且居住在昆明市，漢族。其中男178 例，女174 例，年齡（52.53 ± 10.92）歲，平均病程6.05 年。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他類型糖尿病和（或）有糖尿病急性并發(fā)癥；有心腦血管、血液系統(tǒng)、自身免疫性及其他內(nèi)分泌代謝疾??；近期有感染、手術(shù)、創(chuàng)傷等應(yīng)激因素；嚴(yán)重肝腎功能不全。同期選取本院體檢中心昆明地區(qū)漢族人群體檢結(jié)果正常且無(wú)糖尿病史者186 例作為對(duì)照組，男101 例，女85 例，年齡（51.90 ± 5.27）歲。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兩組均簽署知情同意書(shū)。

1.2 GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) 采用PCR 法與單向基因測(cè)序法。DNA 提?。哼x用EDTA抗凝管取兩組外周靜脈血4 mL，按照全血基因組DNA 提取試劑盒（北京博邁德科技發(fā)展有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將提取的DNA 溶液放置-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR 擴(kuò)增：PCR 反應(yīng)體系 25 μL，其中DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2× Tap PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，72 ℃終末延伸7 min，共35 個(gè)循環(huán)，4 ℃保溫1 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)的引物（上游序列5'-TTGAGCGCACCTTGCGTGTG-3'、下游序列5'-ACTGTGAGCTGGGAGTTGCC-3'）送上海生物工程有限公司，檢測(cè)其基因多態(tài)性。

1.3 血漿GAS6 水平檢測(cè) 采集兩組清晨空腹外周靜脈血4 mL，置于EDTA 抗凝管中顛倒混勻，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑15 cm，分離血漿，于-20 ℃凍存。采用ELISA 雙抗體夾心法檢測(cè)血漿GAS6。ELISA 試劑盒購(gòu)自無(wú)錫東林科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.4 HbA1c、FPG 檢測(cè)及 IR 指數(shù)（HOMA-IR）計(jì)算 血液標(biāo)本采集同1.3，用高效液相色譜法檢測(cè)HbA1c、葡萄糖氧化酶法檢測(cè)FPG、放射免疫法檢測(cè)空腹胰島素（FINS），計(jì)算 HOMA-IR，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5［10］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用中位數(shù)±四分位間距［M（Q）］表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；用Spearman 相關(guān)法分析血漿GAS6 水平與HbA1c、FPG、HOMA-IR 的相關(guān)性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基因測(cè)序結(jié)果 GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)的三種基因型分別為GG、GA、AA。兩組均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P均>0.05）。兩組GAS6基因rs8191974位點(diǎn)基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.360，P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組GAS6基因rs8191974位點(diǎn)等位基因型頻率比較（%）

2.2 兩組 HbA1c、FPG、HOMA-IR 及血漿 GAS6 水平比較 兩組三種基因型之間HbA1c、FPG、HOMAIR 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），而GAS6 水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組GG 基因型血漿GAS6 水平比GA、AA 基因型低（P均<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 T2DM 組 血 漿 GAS6 水 平 與 HbA1c、FPG、HOMA-IR 的相關(guān)性 剔除年齡、性別因素后，行偏相關(guān)分析，T2DM 組血漿 GAS6 水平與 HbA1c、FPG、HOMA-IR無(wú)相關(guān)性（r分別為-0.217、-0.344、-0.186，P均>0.05）。

表2 兩組HbA1c、FPG、HOMA-IR及血漿GAS6水平［M（Q）］

3 討論

GAS6 基因由678 個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列與血漿抗凝蛋白S 有44%的同源性，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起負(fù)性調(diào)節(jié)作用［11］。Axl 是受體酪氨酸激酶家族成員之一，與Gas6 結(jié)合后激活自身酪氨酸激酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、趨化、黏附和識(shí)別等多種生理功能［12］。有研究報(bào)道，通過(guò)基因敲除阻斷GAS6/Axl信號(hào)通路會(huì)使小鼠的血糖水平升高，脂肪沉積增加，導(dǎo)致小鼠T2DM 發(fā)病。GAS6/Axl信號(hào)通路的激活有助于促進(jìn)骨骼肌PI3K/AKT的磷酸化，增加骨骼肌中Glut4向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，促進(jìn)小鼠體內(nèi)血糖吸收［13］。

GAS6 與炎癥、肥胖和IR 相關(guān)，但結(jié)論存在爭(zhēng)議。如有研究顯示，在青少年男性中，GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn) A 等位基因和 rs8191973 位點(diǎn) C 等位基因攜帶者的腰圍、BMI、IL-6 和 hs-CRP 水平低于GG基因型，同樣Axl基因rs2304232位點(diǎn)A等位基因攜帶者的IL-6、胰島素及HOMA-IR 水平低于GG 基因型。提示肥胖和炎癥的易感性可能與GAS6 基因rs8191974、rs8191973 及 Axl 基因 rs2304232 位點(diǎn)的GG 基因型存在相關(guān)性［14］。但對(duì)亞洲成年人的研究卻未發(fā)現(xiàn)肥胖與GAS6 基因多態(tài)性存在相關(guān)性［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM 組 GAS6 基因 rs8191974 位點(diǎn) GG基因型頻率高于對(duì)照組，而GA 和AA 基因型頻率低于對(duì)照組，但三種基因型HbA1c、FPG、HOMA-IR 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而GG 基因型血漿GAS6 水平比GA、AA 基因型低。因此，推測(cè)昆明漢族T2DM 患者 GAS6 基因 rs8191974 位點(diǎn) GA、AA 基因型攜帶者發(fā)生T2DM的風(fēng)險(xiǎn)比GG基因型攜帶者低。

有研究顯示，成年女性血漿GAS6 水平與胰島素敏感性存在相關(guān)性，與腰圍、腰臀比（WHR）、BMI、HOMA-IR、IL-6 水平呈負(fù)相關(guān)；然而，在成年男性中卻未發(fā)現(xiàn)血漿GAS6 水平與上述指標(biāo)有相關(guān)性，原因可能為性激素對(duì)GAS6/TAM 系統(tǒng)的潛在調(diào)節(jié)作用［16-17］。不同人群中血漿 GAS6 與炎癥、肥胖、IR 的相關(guān)性有差異，考慮可能與性別、年齡及性激素等因素有關(guān)。目前多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，血漿GAS6 水平與血糖水平呈負(fù)相關(guān)［17-20］，因此，糖尿病與 GAS6 基因多態(tài)性有關(guān)，血漿GAS6 水平對(duì)肥胖、IR、糖代謝及炎癥的發(fā)生也有影響［14，21-23］。而本研究發(fā)現(xiàn)，血漿GAS6水平與HbA1c、FPG、HOMA-IR無(wú)相關(guān)性，考慮T2DM 是一種遺傳異質(zhì)性疾病，遺傳和環(huán)境因素共同參與、相互作用導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，研究結(jié)果的不一致可能與種族和地域的異質(zhì)性及實(shí)驗(yàn)方法、樣本量等因素有關(guān)。

綜上所述，昆明地區(qū)漢族T2DM 患者的GG 基因型頻率、G 等位基因頻率高，而GA、AA 基因型頻率及A 等位基因頻率低，且其血漿GAS6 水平低。T2DM 是一種多基因遺傳病，其遺傳基礎(chǔ)不能用單個(gè)基因效應(yīng)來(lái)解釋。因此，為進(jìn)一步闡明GAS6 基因多態(tài)性及其血漿水平與T2DM 的關(guān)系，還需進(jìn)行多中心臨床研究，收集不同種族和區(qū)域的人群，加大樣本含量，使研究結(jié)果更科學(xué)、更全面。