厭氧消化滅活畜禽糞污中病原菌的研究進(jìn)展

任麗娟, 林 敏, 董仁杰, 喬 瑋

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院， 北京 100083； 2.國家能源生物燃?xì)飧咝е苽浼熬C合利用技術(shù)研發(fā)實驗中心(中國農(nóng)業(yè)大學(xué))， 北京 100083)

我國每年產(chǎn)生約38億噸畜禽糞污[1]，如果處置不當(dāng)會成為重要的環(huán)境污染源。厭氧消化可以產(chǎn)生沼氣和沼肥，是畜禽糞污的主要處理方式。但是，畜禽糞污中含有大量病原菌(如：大腸桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌等)，種類多、生理特性復(fù)雜，如果不經(jīng)有效殺滅就進(jìn)入環(huán)境，會對生態(tài)和人群健康造成危害[2]。有研究報道，在厭氧消化的沼液沼渣土地利用周圍，有居民患皮疹、紅眼病、嗓子痛和肺病等疾病[3]。在厭氧消化過程中高效殺滅病原菌對畜禽糞污的處理非常重要。厭氧消化過程中的多種因素，如發(fā)酵底物濃度、揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acids, VFAs)和發(fā)酵溫度等均對病原菌的滅活起到非常重要的作用。同時，細(xì)菌在特定環(huán)境中還具有進(jìn)入活的但不可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but non-culturable, VBNC)的特征，通過常規(guī)最大或然數(shù)法(Most probable number, MPN)不能將其檢出，增加了病原菌的環(huán)境控制風(fēng)險[4]。為此，本文分析了國內(nèi)外厭氧消化有關(guān)病原菌滅活影響因素的文獻(xiàn)，從病原菌控制的角度為研發(fā)厭氧消化工藝提供新的思路。

1 病原菌的常見種類、危害、致病途徑及控制標(biāo)準(zhǔn)

1.1 常見種類及危害

常見的病原微生物包括細(xì)菌、病毒、原生動物和蠕蟲卵，其中病原菌主要有大腸桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌和腸球菌等。這些病原菌的生理特性、結(jié)構(gòu)特點以及含量在不同的畜禽糞污中均有所不同。已報道的常見病原菌及其危害如表1所示。其中，沙門氏菌常見于牛糞和豬糞中，含量分別為106CFU·g-1以上和106～107CFU·g-1，能夠引起傷寒、急性腸胃炎和急性敗血癥等疾病。大腸桿菌在牛糞、羊糞、雞糞和豬糞中均能被檢測到，在牛糞中含量較高，達(dá)107～108CFU·g-1，可致人患重癥水瀉、脫水等。牛糞和羊糞中的彎曲桿菌，會隨廢水排放而污染水源，是許多工業(yè)化國家人群急性腹瀉、腹痛的主要致病菌[5]。分布于豬糞中的腸球菌被檢測到含量約為105～106CFU·g-1，能夠通過糞口傳播進(jìn)入人體腸道，導(dǎo)致腹瀉、腹痛等癥狀。

表1 幾種常見病原菌及其危害

1.2 致病途徑

病原菌與人群接觸，并致人患病的途徑主要有以下幾個方面。1)消化道：人類被感染致病，多數(shù)是因為畜禽糞污污染了地表水或地下水，人在飲用被污染的水之后引起的[15]。厭氧消化后的沼液沼渣如處理或處置不當(dāng)，便會污染地表水、地下水和土壤。人群通過手和衣服等接觸病原菌后，將病原菌帶入食物鏈，飲用受到污染的水和食用種植在被污染土壤上的糧食作物后而患病[16]。2006年7月，深圳羅湖區(qū)某小區(qū)爆發(fā)了一起由產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)引起的群體性腹瀉。該小區(qū)二次供水系統(tǒng)受到污染，居民不良的個人衛(wèi)生習(xí)慣是導(dǎo)致疾病爆發(fā)的主要原因[17]； 2)呼吸道：在土地耕作、收獲作物和刮大風(fēng)時，施加到土壤表層的沼液沼渣中的病原菌會通過空氣彌散，與水、塵埃等凝結(jié)成微小顆粒懸浮在空氣中，形成微生物氣溶膠或粉塵，可引起人類患病[18]； 3)皮膚創(chuàng)口：當(dāng)人們通過手或者衣服直接或間接接觸到病原菌時，其會經(jīng)過皮膚傷口包括燙傷、劃傷以及手術(shù)傷等侵入人體使人患病，如金黃色葡萄球菌、炭疽芽孢桿菌等[19]。

1.3 病原菌控制標(biāo)準(zhǔn)

不同種類的病原菌，由于其毒性、生長和繁殖條件不同，能夠致人患病的數(shù)量也不同。如傷寒沙門氏菌致人患病的數(shù)量是108～109個·人-1，痢疾志賀氏菌是7個·人-1[19]。為了保證病原菌含量低于可致人患病范圍，國內(nèi)外制定了相應(yīng)的控制標(biāo)準(zhǔn)，如表2和表3所示。在英國、歐盟和愛爾蘭，要求大腸桿菌的菌落形成單位(CFU)在每克新鮮物質(zhì)中要少于103個，沙門氏菌不得在50 g，25 g，25 g新鮮物質(zhì)中檢出。美國和法國則要求沙門氏菌的最大或然數(shù)(MPN)分別為4 g總固體中少于3個，10 g總固體中少于8個。美國環(huán)保署“503”法案中AB兩級標(biāo)準(zhǔn)對糞大腸菌群的數(shù)量要求分別少于103MPN·g-1TS，2×106MPN·g-1TS。我國《畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18596—2001)中要求處理后畜禽糞便中的糞大腸菌群少于105個·kg-1；《畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范》(GB36195—2018)中規(guī)定常溫沼氣發(fā)酵和高溫沼氣發(fā)酵處理后糞大腸菌群的數(shù)量分別少于105個·L-1，102個·L-1；《糞便無害化衛(wèi)生要求》(GB7959—2012)對不同消化工藝污泥中含有的糞大腸菌群數(shù)量要求不同，中常溫、高溫、兼性厭氧發(fā)酵分別少于104個·L-1，102個·L-1，104個·L-1；我國《農(nóng)用污泥污染物控制標(biāo)準(zhǔn)》(GB4284—2018)要求糞大腸菌群的數(shù)量少于105個·L-1；《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918—2002)中的一級標(biāo)準(zhǔn)分為AB兩級，對糞大腸菌群的要求分別少于103個·L-1，104個·L-1，二級標(biāo)準(zhǔn)要求少于104個·L-1。美國和法國要求腸道病毒的菌落形成個數(shù)(PFU)在4 g總固體和10 g總固體中分別少于1個和3個。美國對活性蠕蟲卵的要求是少于1個活卵·4 g-1TS，歐盟要求其死亡率要多于3log10，法國則要求少于3個活卵·10 g-1TS。我國《畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18596—2001)、《畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范》(GB36195—2018)和《農(nóng)用污泥污染物控制標(biāo)準(zhǔn)》(GB4284—2018)均要求蠕蟲卵的死亡率超過95%?！都S便無害化衛(wèi)生要求》(GB7959—2012)對常溫、中溫厭氧消化要求蠕蟲卵的沉降率超過95%，高溫厭消化要求蠕蟲卵的死亡率超過95%。此外，我國的《畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范》(GB36195—2018)和《糞便無害化衛(wèi)生要求》(GB7959—2012)中對血吸蟲和鉤蟲的要求是不得檢出活卵。從表2可以看出，歐美等發(fā)達(dá)國家從20世紀(jì)90年代就開始關(guān)注病原菌的問題并制定了相應(yīng)的控制標(biāo)準(zhǔn)，而由表3可知 ,我國關(guān)注得則較晚,且對于病原菌種類來說，我國目前的各種控制標(biāo)準(zhǔn)并沒有國外全面。

表2 病原微生物的控制標(biāo)準(zhǔn)

表3 我國病原微生物的控制標(biāo)準(zhǔn)

2 厭氧消化滅活病原菌的影響因素

2.1 發(fā)酵底物濃度

底物濃度是導(dǎo)致腸道細(xì)菌在中溫厭氧消化過程中滅活的主要因素之一。有研究發(fā)現(xiàn)，在豬糞和餐廚垃圾混合干式中溫(37℃)厭氧共消化系統(tǒng)中，將進(jìn)料總固體(Total Solid, TS)稀釋至20%，沙門氏菌的滅活時間將從濕式厭氧消化的幾個月縮短至6～7天[30]。在進(jìn)行剩余污泥高溫厭氧消化時發(fā)現(xiàn)，進(jìn)料剩余污泥的TS在28～45 g·L-1時，大腸桿菌的殺滅數(shù)量隨著底物濃度的增加而增加；當(dāng)TS為45 g·L-1時，總大腸桿菌的滅活效果達(dá)到99.89%；當(dāng)TS超過45 g·L-1時，雖然滅活率總能保持在98%以上，但是卻出現(xiàn)濃度過高滅活效果反而緩慢下降的趨勢[31]。對餐廚垃圾和豬糞混合中溫(37℃)厭氧共發(fā)酵，進(jìn)料TS為20%，大腸桿菌的數(shù)量4天內(nèi)迅速從6.2×108CFU·g-1下降到最低檢測限(100 CFU·g-1)以下[32]。干式厭氧消化中的高底物濃度可能會導(dǎo)致較高濃度的VFAs，雖然能夠提高病原菌的滅活效果，但是較高濃度的VFAs容易積累，使產(chǎn)甲烷過程受到抑制，嚴(yán)重干擾厭氧工程平穩(wěn)運行。因此，關(guān)于底物濃度對厭氧消化過程中病原菌的滅活效果還需同時考慮較高底物濃度帶來的負(fù)面影響。

2.2 pH值和揮發(fā)性脂肪酸

pH值是厭氧消化過程中殺滅病原菌的一個重要影響因素。有研究指出，對豬糞進(jìn)行中溫厭氧消化24 h，鼠傷寒沙門氏菌可以在pH值為6.8的條件下存活，但是卻不能在pH值為4.0的條件下存活[33]。此外，揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acids, VFAs)作為厭氧消化產(chǎn)甲烷過程的中間產(chǎn)物，對病原菌的滅活也起到了重要的作用。揮發(fā)性脂肪酸進(jìn)入病原菌細(xì)胞并產(chǎn)生破壞性作用的原理如圖1所示。在較低的pH值條件下，VFAs多以分子態(tài)存在[34]。游離VFAs具有親脂性，可以穿過細(xì)菌細(xì)胞膜在細(xì)胞中解離，產(chǎn)生的氫離子使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部pH值下降，對病原菌更具破壞性[35]。細(xì)胞內(nèi)酸堿度的降低最終會降低質(zhì)子的動力，導(dǎo)致三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生速度變慢，從而限制了細(xì)胞的生長，抑制病原菌致病基因的表達(dá)[36]。此外，進(jìn)入細(xì)胞的酸根離子可以抑制細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)的合成過程，破壞細(xì)菌的繁殖進(jìn)程[37]。VFAs濃度越高，病原菌的滅活效率就越高[38]。在對豬糞和餐廚垃圾中溫厭氧共消化時發(fā)現(xiàn)游離VFAs是總大腸菌群和大腸桿菌滅活的重要因素，1 mg·L-1的VFAs可使總大腸菌群和大腸桿菌的數(shù)量分別減少0.184和0.174 log10CFU·g-1[30]。對城市廢水污泥進(jìn)行中溫(35℃)厭氧消化，當(dāng)VFAs濃度大于6000 mg·L-1時，沙門氏菌經(jīng)過24 h后由110 CFU·mL-1下降至30 CFU·mL-1；當(dāng)VFAs濃度為750 mg·L-1時，沙門氏菌僅降至90 CFU·mL-1[39]。另外，有研究表明，關(guān)于pH值和VFAs對病原菌的滅活效果之間存在相互促進(jìn)作用。對牛糞中溫厭氧消化時，在VFAs為5000 mg·L-1，pH值為6.0的條件下，傷寒沙門氏菌數(shù)量迅速下降，12天內(nèi)可完全消除，而在VFAs為100 mg·L-1，pH值為6.8下則需要26天[40]。對污泥進(jìn)行中溫(37℃)厭氧消化的過程中，如果系統(tǒng)的初始pH值在5.5以下，當(dāng)VFAs處于較高濃度范圍5000～7000 mg·L-1時，兩天內(nèi)沙門氏菌便可以被滅活；而當(dāng)pH值處于中性或者堿性條件時，即使VFAs濃度高達(dá)9000 mg·L-1，對病原菌的滅活作用也不明顯[41]。高濃度VFAs和較低的pH對于病原菌的滅活具有協(xié)同作用，需要同時考慮這兩種因素對病原菌的滅活機(jī)理。

常見揮發(fā)性脂肪酸在水溶液中的解離常數(shù)如表4所示。甲酸、乙酸、丙酸、丁酸在pH值為0～7的條件下，分子態(tài)酸和離子態(tài)酸的比例如圖2。從圖2可以看出，隨著pH值的升高，離子態(tài)酸比例在上升，分子態(tài)酸比例在下降。由于分子態(tài)酸對病原菌更具破壞性，所以高pH值條件下對病原菌的滅活效果也可能會降低。

表4 常見揮發(fā)性脂肪酸在水溶液中的解離常數(shù)(25℃)

2.3 發(fā)酵溫度

厭氧消化一般可分為高溫厭氧消化(50℃～55℃)和中溫厭氧消化(30℃～42℃)。發(fā)酵溫度是病原菌滅活的重要影響因素之一。高溫能夠直接影響病原菌的細(xì)胞膜組成，比中溫殺菌效果好[42]。細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中鑲嵌著許多有運輸功能的蛋白質(zhì)(占比50%～70%)，控制細(xì)胞內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的運送；此外，細(xì)胞膜上還存在與氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代謝有關(guān)的酶，可使細(xì)胞膜內(nèi)外形成電位差，為細(xì)胞產(chǎn)能[19]。在較高的溫度條件下，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)變性、酶失活，影響病原菌的生長代謝和繁殖，最終導(dǎo)致其死亡。對于中溫厭氧消化來說，其溫度是許多病原菌和病毒(腸道病毒)的適宜生長溫度，對病原菌的滅活效果較高溫差[10]。牛糞在35℃條件下厭氧消化5天后，大腸桿菌的去除率可達(dá)到99.6%，而在室溫下相同的時間只能達(dá)到6.86%[43]。對奶牛糞進(jìn)行批次厭氧消化時，35℃下鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的數(shù)量減少90%所需時間分別為2.4天、0.9天和1.8天，而在53℃條件下，以上3種病原菌的數(shù)量減少90%所需時間則為0.7小時、0.4小時和0.4小時[44]。在對豬糞進(jìn)行厭氧消化時(4℃～52℃)，大腸桿菌在4℃的豬糞中最多可存活24天，在較高的溫度下僅能存活7天(15℃)或6天(22℃)，而在42℃和52℃下存活時間只有幾小時[45]。在牛糞批次厭氧消化實驗中，溫度為低溫(25℃)、中溫(37℃)和嗜熱(52.5℃)時，大腸桿菌的去除量達(dá)到90%所需的時間分別為9～10天，7～8天和少于1天；在52.5℃時滅活率分別是25℃和37℃的17倍和15倍[46]。美國環(huán)保署指出，正常運行的兩相厭氧消化工藝和高溫厭氧消化工藝的出泥均能達(dá)到A類污泥排放標(biāo)準(zhǔn)(見表2)，而中溫厭氧消化工藝的出泥則是B類(見表2)[47]。雖然從病原菌控制的角度考慮，高溫發(fā)酵工藝是更好的選擇。但是，目前工程中較多采用的仍是中常溫發(fā)酵工藝。主要是由于高溫厭氧消化工藝能耗較高，投入更大，工藝穩(wěn)定性差，使其應(yīng)用受到一定限制。有數(shù)據(jù)顯示，德國90%的沼氣工程采用中溫發(fā)酵，大約9%的沼氣工程采用高溫發(fā)酵。中國普遍采用常溫發(fā)酵[48]。

2.4 停留時間的影響

一般來說，停留時間越長對病原菌的滅活效果越好。在豬糞和餐廚垃圾中溫(35℃～37℃)厭氧共消化系統(tǒng)中，平均停留時間為20天時，金黃色葡萄球菌SA11的細(xì)胞數(shù)量從8.69 logCFU·mL-1下降到2.77 logCFU·mL-1，且停留時間每增加一天，腸球菌的數(shù)量減少0.126 logCFU·mL-1；據(jù)推測，隨著物料在消化池中停留時間的延長，也可能會導(dǎo)致金黃色葡萄球菌SA11細(xì)胞的完全失活[49]。在污泥中溫厭氧消化中，大腸桿菌可在40～60天內(nèi)降至103CFU·g-1以下(減少了3.6～6 log10)，而停留時間為20天時僅實現(xiàn)了1～2 log10的減少量[10]。停留時間和溫度之間還存在協(xié)同作用。對豬糞和餐廚垃圾進(jìn)行中溫厭氧共消化時，6～7天才能完全消除沙門氏菌[30]。而在高溫條件下，對污水污泥進(jìn)行厭氧消化時，沙門氏菌只需在20～60分鐘就能被完全消除[50]。也有研究指出延長停留時間對某些病原菌并沒有明顯的影響。對豬糞進(jìn)行中溫(39℃)厭氧消化，將停留時間由21天增加至41天后，大腸桿菌的去除量稍微增加但是并不明顯，濃度基本都處在2.0～2.5 logCFU·g-1之間[51]。由此可見，停留時間不是影響病原菌去除效果的單一因素，而可能和其他因素有關(guān)，是影響病原菌滅活效率的間接因素。

2.5 氨氮的影響

在厭氧消化過程中，隨著蛋白質(zhì)等有機(jī)含氮物質(zhì)降解轉(zhuǎn)換為氨氮，系統(tǒng)中氨氮濃度有所升高，對產(chǎn)甲烷過程產(chǎn)生一定抑制。但是，研究發(fā)現(xiàn)氨氮對病原菌的滅活具有積極作用[52]。游離氨(NH3)具有親脂性，可以通過細(xì)菌細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行解離，使pH值升高，對病原菌有毒害作用。不同pH值下分子態(tài)和離子態(tài)氨氮的比例如圖3所示。從圖3可以看出，隨著pH值增加，離子態(tài)氨氮所占比例在下降，分子態(tài)氨氮所占比例在上升。由于分子態(tài)氨氮對病原菌更具有破壞性，所以病原菌的滅活率也可能逐漸上升。對豬糞進(jìn)行中溫(39℃±1℃)厭氧消化，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和腸桿菌等含量與分子氨(NH3)含量之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明分子態(tài)氨氮能促進(jìn)病原菌的殺滅效果[53]。污泥37℃中溫厭氧消化時，在高氨氮水平下(6.9 g·L-1)，沙門氏菌和腸球菌減少5個對數(shù)所需的時間相較氨氮含量為0.9 g·L-1的16天和19天分別從減少到1.6天和4.2天[54]。一般來說，氨氮濃度越高，殺菌效果越好。但是，厭氧消化系統(tǒng)中氨氮濃度過高會抑制產(chǎn)甲烷菌的活性[55]。有研究表明，當(dāng)有機(jī)負(fù)荷率和水力停留時間設(shè)置合理時，厭氧消化產(chǎn)甲烷系統(tǒng)也可以在很高的氨氮濃度下(6000 mg·L-1)正常運行，打破了以往對氨氮含量抑制厭氧消化的判斷[56]。由此可見，對含氮量高的原料進(jìn)行厭氧處理時，存在氨氮促進(jìn)病原菌滅活的積極作用，但同時也要考慮過高氨氮對發(fā)酵可能造成的不利影響。

2.6 病原菌生理抗性的影響

不同的病原微生物對厭氧消化環(huán)境具有不同的抗性，依次為：可以形成芽孢的革蘭陽性菌>不能形成芽孢的革蘭陽性菌>線蟲≥革蘭氏陰性菌≥病毒[42]。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中厚厚的多層肽聚糖和磷壁酸可以作為滲透性屏障，防止有毒因子進(jìn)入細(xì)胞；而革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁則薄得多，僅包含單層的肽聚糖和富含脂質(zhì)的外膜，幾乎不能作為滲透性屏障提供保護(hù)，游離態(tài)VFAs更容易穿過其細(xì)胞膜[57]。這可能是導(dǎo)致在相同條件下革蘭氏陰性菌(大腸桿菌等)比革蘭氏陽性菌(腸球菌等)更容易失活的原因。有研究指出，將細(xì)菌和寄生蟲卵保存在溫度為55℃的糞肥(牛糞、豬糞)濾袋中，在消化池中放置24 h后，沒有發(fā)現(xiàn)有活力的沙門氏菌(革蘭氏陰性菌)或豬蛔蟲卵[58]。而在溫度為55℃的連續(xù)攪拌反應(yīng)器中，卻無法完全殺滅牛糞中的隱孢子蟲，達(dá)不到控制標(biāo)準(zhǔn)[6]。對牛糞進(jìn)行中溫(35℃)厭氧消化時發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和傷寒沙門氏菌能夠存活10天；痢疾桿菌只能存活5天；糞鏈球菌的存活時間最長，可存活15天[43]。病毒的核糖核酸(RNA)和蛋白質(zhì)衣殼是其主要的抗性機(jī)制，但其抗性相較前幾種病原微生物較弱。有研究表明，在4℃下對初沉池的污泥持續(xù)厭氧消化10天，脊髓灰質(zhì)炎病毒的致病性可下降99%，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)其RNA基因組被切割，蛋白質(zhì)衣殼裂解[59]。不同種類的病原菌體現(xiàn)出不同的抗性，這與其自身的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有直接聯(lián)系。

2.7 生態(tài)位的影響

生態(tài)位是指一個種群在生態(tài)系統(tǒng)中，在時空上所占據(jù)的位置及與其相關(guān)生物種群之間的功能關(guān)系與作用。溫度，VFAs，氨氮等都是生態(tài)位時空的一部分。每個物種只有一個生態(tài)位且不能重疊，若有重疊，必然會通過物種間的競爭減少重疊，以達(dá)到系統(tǒng)穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，厭氧消化過程中一些常見厭氧菌的生長能夠抑制沙門氏菌的生長。通過向污泥中溫厭氧消化池中加入沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌并沒有生長，50 h內(nèi)沙門氏菌的死亡率達(dá)到了99%[60]。表明厭氧菌群可能會產(chǎn)生某種酶或者抑制產(chǎn)物，最終導(dǎo)致沙門氏菌的死亡。不同厭氧工藝的消化污泥在室溫下放置20 t后，病原菌數(shù)量均下降了2～3個數(shù)量級[61]。這可能是在室溫儲存過程中，厭氧菌與病原菌競爭代謝基質(zhì)，導(dǎo)致病原菌由于營養(yǎng)物質(zhì)不足而逐漸死亡。

關(guān)于厭氧消化過程中常見病原菌和厭氧菌的生理特性如表5所示。從表5可以看出，大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的最適生長溫度都處于30℃～37℃之間，厭氧菌在中溫和高溫各有1個適宜生長的溫度范圍，能夠適應(yīng)的溫度范圍較前幾種病原菌寬。另外，這幾種病原菌適宜生存的pH值都處于6.0～8.0，而發(fā)酵細(xì)菌和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌能在pH值(5.0～6.0)較低的環(huán)境中生存，產(chǎn)甲烷菌能夠在pH值6.8～7.2條件下生存，耗氫產(chǎn)乙酸菌能夠適應(yīng)的pH值范圍則更大，為5.0～8.3。對于厭氧消化中的水解階段來說，適應(yīng)較酸環(huán)境的發(fā)酵細(xì)菌和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌能夠生長較好而上述幾種病原菌卻可能因環(huán)境pH值較低而被滅活。此外，上述幾種病原菌均能利用葡萄糖進(jìn)行繁殖代謝，而厭氧菌中的耗氫產(chǎn)乙酸菌也能夠利用葡萄糖，其對葡萄糖的底物競爭也可能是導(dǎo)致厭氧消化過程中病原菌滅活的原因。另外，大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌均為革蘭氏陰性菌，厭氧菌中既有革蘭氏陰性菌也有革蘭氏陽性菌，比病原菌能更好地適應(yīng)厭氧環(huán)境，而厭氧菌生長繁殖越旺盛，對病原菌的抑制作用越強。這也從一定程度上解釋了為什么厭氧消化系統(tǒng)能起到滅活病原菌的作用，但是厭氧菌卻能在其中很好地生存。關(guān)于厭氧消化過程中其他厭氧微生物對于病原菌抑制作用的確定分析較少，其機(jī)理仍需進(jìn)一步探究。

表5 常見病原菌和厭氧菌的生理特性比較

3 細(xì)菌存在VBNC狀態(tài)的影響

3.1 VBNC狀態(tài)

某些細(xì)菌為了抵抗不良環(huán)境繼續(xù)存活，會進(jìn)入活的但不可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but non-culturable, VBNC)[72]。處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌不能在常規(guī)微生物培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通常不會引發(fā)疾病，但并不代表它們不具有毒性。它們?nèi)员Ａ舳玖?，并且在?fù)蘇到活躍代謝狀態(tài)后仍可以致人患病[73]。通過MPN和q-PCR方法對牛糞中大腸桿菌的數(shù)量進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與MPN相比q-PCR方法的結(jié)果高出100倍，這種差異表明大多數(shù)的大腸桿菌是不可培養(yǎng)的[9]。污泥在高溫55℃，固體停留時間(Solid retention time, SRT)15～20天條件下進(jìn)行厭氧消化，進(jìn)水中大腸桿菌濃度約為107CFU·g-1，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法測量出水中大腸桿菌的濃度為2×101CFU·g-1，而通過c-PCR技術(shù)測得大腸桿菌的濃度為7×105CFU·g-1，兩者相差四個數(shù)量級，也說明了有VBNC狀態(tài)的病原菌存在[74]。

3.2 誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的因素

迄今為止，已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)80余種細(xì)菌能夠在不利環(huán)境條件下進(jìn)入VBNC狀態(tài)。包括大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、結(jié)核桿菌、痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌等。據(jù)報道，誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的因素有很多，主要包括溫度、營養(yǎng)物質(zhì)、pH值、鹽度、氧含量和光照等[4]。處于VBNC狀態(tài)下的細(xì)菌仍然是活的，能夠保持細(xì)胞完整性，且能夠維持正常生理活動，包括呼吸作用、基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成等[75]。盡管它們的代謝水平較低，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞壁的組成會發(fā)生一系列改變，但復(fù)蘇后仍可以進(jìn)行培養(yǎng)。因此，細(xì)菌存在VBNC狀態(tài)的影響是評估厭氧消化過程中病原菌殺滅效果好壞的一個重要因素。

4 結(jié)論

厭氧消化能夠滅活畜禽糞污中的病原菌，但是不同的工藝條件、不同的原料，對病原菌的滅活效率有很大差異。厭氧消化中對病原菌的滅活是一個復(fù)雜的控制過程，關(guān)于病原菌滅活的影響因素有很多。這些因素之間相互影響，共同決定了病原菌的滅活效果，其滅活機(jī)理仍需要進(jìn)一步探索和明確。厭氧消化中間代謝產(chǎn)物對滅活病原菌效果有促進(jìn)作用，但同時也可能會對厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。因此，要合理選擇和調(diào)控厭氧消化工藝條件，實現(xiàn)高效發(fā)酵與病原菌去除的雙重目標(biāo)。此外，以往認(rèn)為被滅活的病原菌，有可能是進(jìn)入了VBNC狀態(tài)，而并未被真正殺死，加大了后續(xù)控制病原菌的難度。因此，需要進(jìn)一步探究病原菌的真實滅活效果，改進(jìn)厭氧消化工藝。