單葉刺槐半同胞子代葉片的滯塵能力及葉表SEM特征分析*

徐立人，劉寵，張軍，柳俊明，王立成，李清泉，楊敏生，李彥慧

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；3.河北省保定市滿城區(qū)苗圃場(chǎng)，河北 保定 071000)

大氣污染已成為目前最受關(guān)注、最為嚴(yán)重的生態(tài)問題，而空氣顆粒物是大氣的首要污染物，其中含有的大量重金屬元素及其他有害成分嚴(yán)重影響了人類健康及生活質(zhì)量[1]?？諝忸w粒物中直徑小于等于10 μm(PM10)的顆粒物，由于其可以直接進(jìn)入呼吸道，稱為可吸入顆粒物。其中粒徑小于等于2.5 μm(PM2.5)的微粒，由于其附著能力強(qiáng)，表面積大，可攜帶大量細(xì)菌、病毒直接進(jìn)入人體血液循環(huán)中，引發(fā)大量疾病，對(duì)人類健康的危害極大[2-4]。

刺槐(RobiniapseudoaciaL.)，又名洋槐，屬豆科(Leguminosae)刺槐屬(RobiniaLinn)多年生落葉喬木。其萌芽性強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)、耐干旱、生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)性強(qiáng)，是水土保持、防風(fēng)固沙、土壤改良、園林綠化及提供蜜源和飼料的優(yōu)良樹種，現(xiàn)已成為我國(guó)北方優(yōu)良的水土保持樹種[5-7]。單葉刺槐(Robiniapseudoacaciaf.unifolia)是刺槐的變種，主要特征是復(fù)葉僅有一個(gè)或幾個(gè)小葉片，葉片的長(zhǎng)寬明顯大于普通刺槐。2004年從德國(guó)引進(jìn)了單葉刺槐無(wú)性系，發(fā)現(xiàn)其與普通刺槐混栽，可產(chǎn)生種子，半同胞家系中復(fù)葉的小葉數(shù)、葉面積等發(fā)生明顯的變異[8]。目前，對(duì)園林綠化樹種滯塵能力的研究主要集中在不同樹種之間的縱向?qū)Ρ?，且大多針?duì)的為單一滯塵指標(biāo)，尚無(wú)對(duì)同樹種不同無(wú)性系滯塵能力的研究[9-12]，對(duì)單葉刺槐及其半同胞子代的研究也僅限于組培體系的建立[13]和子代SSR鑒定[8]等。

本試驗(yàn)以單葉刺槐及6個(gè)半同胞子代無(wú)性系5月的當(dāng)年生葉片為材料，測(cè)定其單位面積總滯塵量，同時(shí)運(yùn)用Mastersizer 2000儀器測(cè)定其粒徑分布，利用掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)掃描各樣本葉表面圖像，比較各無(wú)性系對(duì)不同粒徑塵土吸附量的差異，探討單葉刺槐吸附塵土的機(jī)理及影響因素，采用隸屬函數(shù)法、聚類分析法對(duì)各無(wú)性系的滯塵能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為今后單葉刺槐在園林中的合理應(yīng)用及遺傳改良、新品種選育提供重要的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地保定市滿城區(qū)苗圃場(chǎng)位于河北省保定市滿城區(qū)南韓村鎮(zhèn)，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，夏季高溫多雨，冬季寒冷干燥，四季分明。根據(jù)2019年保定市環(huán)境質(zhì)量公報(bào)，全市空氣質(zhì)量一級(jí)達(dá)標(biāo)天數(shù)僅為30 d，PM2.5年均濃度為58 μg/m3，滿城區(qū)的空氣質(zhì)量近年來在保定市22個(gè)縣(市、區(qū))中，始終位列倒數(shù)前5名，而本試驗(yàn)地所處的滿城區(qū)南韓村鎮(zhèn)在全市236個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中，空氣質(zhì)量排名也較為靠后。

2019年5月5日選取單葉刺槐母本及已通過SSR分子鑒定的26個(gè)子代，嫁接在定植于保定市滿城區(qū)苗圃場(chǎng)的2 a生普通刺槐上，形成27個(gè)無(wú)性系，每個(gè)無(wú)性系嫁接20株，選取母本及6個(gè)葉形產(chǎn)生明顯變異的子代的當(dāng)年生葉片為試驗(yàn)材料(表1)。

表1 各參試無(wú)性系的葉形特征Tab.1 Leaf shape characteristics of all clones

1.1.1 葉表顆粒物測(cè)定及粒度分析

于2020年5月進(jìn)行3次采樣(每次采樣的前7 d無(wú)降雨且風(fēng)速小于5級(jí))，在選定的7個(gè)無(wú)性系中，每個(gè)無(wú)性系選擇生長(zhǎng)狀況良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的5株(5個(gè)重復(fù))進(jìn)行采樣?？紤]到高度對(duì)葉片滯塵能力的影響，分東、南、西、北4個(gè)方向，上、中、下3層均勻采集50 g左右的健康葉片，封存于PE自封袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)重復(fù)平行測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)過程中佩戴PE手套，盡可能避免樣品灰塵脫落及受到污染。

1.1.2 葉表SEM特征分析

2020年5月19日，在選定的樣樹上摘取健康完整的葉片，封存于充氣的PE自封袋(避免葉片因受到擠壓而導(dǎo)致表皮毛受損)，帶回實(shí)驗(yàn)室分析。

1.2 研究方法

1.2.1 葉表滯留顆粒物質(zhì)量測(cè)定方法

參考洪秀玲等[14]的方法并作適當(dāng)改進(jìn)，將采集的葉片用去離子水沖洗的同時(shí)用軟毛刷輕刷上下葉表，之后稱懸濁液質(zhì)量(MT)。用恒溫磁力攪拌器攪拌懸濁液5 min，使懸濁液中的顆粒均勻分布，取30 mL左右的懸濁液于培養(yǎng)皿中，稱質(zhì)量(Mp)。將培養(yǎng)皿置于60℃烘箱中，烘干后稱質(zhì)量(mp)，葉表滯留顆粒物質(zhì)量(M)如下：

①

1.2.2 葉面積計(jì)算方法

參考張桐等[10]的方法并作優(yōu)化，將葉片鋪于純白A4紙上，使用惠普公司生產(chǎn)的 Scanjet 200型掃描儀掃描并保存圖片，使用Adobe Photoshop CS5軟件對(duì)葉面積進(jìn)行測(cè)定。首先新建畫布，參數(shù)設(shè)置為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)紙張(長(zhǎng)為297 mm，寬為210 mm)，將掃描得到的葉片圖片導(dǎo)入畫布，利用軟件自帶的魔棒及油漆桶工具，將圖片底色調(diào)為純白(RGB參數(shù)均為255)，將葉片顏色調(diào)為純黑(RGB參數(shù)均為0)，使用直方圖工具獲得純黑部分百分比。葉片雙面面積計(jì)算公式如下：

葉片雙面面積=純黑部分百分比×A4紙張面積×2 ②

1.2.3 葉表顆粒物粒徑分布測(cè)定

將采集到的葉片使用ddH2O清洗，方法同1.2.1，抽取30 mL懸濁液，封裝于50 mLPE離心管，超聲震蕩后使用馬爾文公司生產(chǎn)的Mastersizer 2000激光粒度儀對(duì)懸濁液進(jìn)行粒徑分析。

1.2.4 葉表SEM特征觀察

將1.2.3中已洗凈的葉片，使用圓孔打孔器(0.5 mm)在葉片邊緣、葉脈兩側(cè)打孔，將得到的圓片參考張俊葉等[11]的方法進(jìn)行前處理、冷凍干燥、粘臺(tái)鍍金，之后使用日立公司生產(chǎn)的SU8100冷場(chǎng)掃描電鏡觀察拍照。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 25.0和Excel 2016軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行有效性檢驗(yàn)、單因素方差分析(Duncan法)、聚類分析、相關(guān)性分析，并繪制圖表。

參考郭燕等[15]的方法，進(jìn)一步利用隸屬函數(shù)法，計(jì)算各滯塵指標(biāo)隸屬度，以各樣本、各指標(biāo)的隸屬度均值作為滯塵能力的綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，聚類分析，對(duì)全部樣本的滯塵能力進(jìn)行排序、分類及綜合評(píng)價(jià)。各滯塵指標(biāo)隸屬度計(jì)算公式如下：

Uij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

③

式中：Uij表示編號(hào)為i的樣本j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，Xij表示編號(hào)為i的樣本j指標(biāo)的測(cè)定值，Xjmin表示所有樣本j指標(biāo)的最小值，Xjmax表示所有樣本j指標(biāo)的最大值，i表示某個(gè)編號(hào)樣本，j表示某一指標(biāo)。

2 材料與方法

2.1 單葉刺槐及各半同胞子代葉表滯塵能力

2.1.1 滯留總顆粒物的能力

葉片的單位葉面積滯留量體現(xiàn)了植物對(duì)空氣中總顆粒物的滯留能力。

由圖1可知，各編號(hào)無(wú)性系的單位葉面積滯留量在39.50～76.32 μg/cm2之間，其中子代B24-3、C24-2、B23-1、C24-1、C23-1的單位葉面積滯留量分別比母本提高了51%、5%、90%、63%、65%；與母本相比，B24-3、B23-1、C24-1、C23-1差異顯著，C24-2不顯著。子代A20-5的單位葉面積滯留量比母本降低了2%，與母本相比無(wú)顯著差異。說明對(duì)滯留空氣中總顆粒物的能力而言，大多數(shù)子代優(yōu)于母本。

圖1 單葉刺槐母本及不同子代總顆粒物滯留能力注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，下同。Fig.1 Capture capacities of particulate matters retained by plant leaves of R.pseudoacacia f.unifolia female parent and different progenies

變異系數(shù)反映了葉片滯塵能力的穩(wěn)定度，7個(gè)無(wú)性系的變異系數(shù)在6%～28%區(qū)間內(nèi)，均低于30%，說明各參試無(wú)性系對(duì)空氣中總顆粒物的滯留能力均較為穩(wěn)定。

2.1.2 葉表滯留顆粒物粒徑分析

(1)葉表PM2.5吸附能力對(duì)比 空氣中的PM2.5(D≤2.5μm)微粒，可通過人類口鼻吸入到細(xì)支氣管和肺泡，直接影響肺的通氣功能，使機(jī)體易處在缺氧狀態(tài)。由葉表滯留顆粒物PM2.5百分比的測(cè)定結(jié)果可知(圖2-A)，子代B23-1、C24-1分別比母本提高7%、15%。與母本相比，C24-1差異顯著，B23-1差異不顯著，子代A20-5、B24-3、C24-2、C23-1分別比母本降低60%、25%、17%、50%，與母本相比均差異顯著。說明就改善大氣PM2.5污染的角度而言，C24-1最優(yōu)，但大多數(shù)子代吸附PM2.5的能力不及母本。

圖2 單葉刺槐母本及不同子代葉片滯留顆粒物粒徑分析注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，下同。Fig.2 Particle size analysis by plant leaves of R.pseudoacacia f.unifolia female parent and different progenies

(2)葉表PM2.5-10吸附能力對(duì)比 空氣中PM2.5-10(2.5μm

(3)葉表PM>10吸附能力對(duì)比 空氣中PM>10(D>10μm)微粒，在人體呼吸時(shí)通常會(huì)被鼻腔和咽喉所阻滯，產(chǎn)生不適感，但并不入肺，對(duì)人體的危害程度相對(duì)較低。由葉表滯留顆粒物PM>10百分比的測(cè)定結(jié)果可知(圖2-C),子代A20-5、B23-1、C24-1分別比母本提高7%、1%、2%，與母本相比，差異均不顯著。子代B24-3、C24-2、C23-1分別比母本降低32%、38%、23%，與母本相比均差異顯著。說明母本及半數(shù)子代對(duì)于空氣中PM>10微粒的吸附能力相對(duì)較強(qiáng)。

(4)葉表滯留顆粒物SSA對(duì)比 SSA(Specticic surface aera)，是供試材料葉表單位質(zhì)量顆粒的表面積之和。SSA值越高，其吸附的有害物質(zhì)量越大，從一定意義上看，環(huán)境效益也就越高。由各參試無(wú)性系SSA的測(cè)定結(jié)果可知(圖2-D)，子代A20-5、C24-1分別比母本提高14%、31%，與母本相比，C24-1差異顯著，A20-5差異不顯著。子代B24-3、C24-2、B23-1、C23-1分別比母本降低27%、24%、25%、33%，與母本相比，C23-1差異顯著，B24-3、C24-2、B23-1差異不顯著。說明子代C24-1吸附有害物質(zhì)的能力較強(qiáng)。

2.2 單葉刺槐及各半同胞子代葉表SEM特征分析

通過對(duì)上下葉表微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行SEM特征分析，可以更詳細(xì)地了解單葉刺槐半同胞子代與母本相比在葉表結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生的微米級(jí)變異。由圖3可知，各樣本間的葉面粗糙程度均有所差異，其中子代C24-1、B23-1的葉面粗糙程度與母本相比顯著提高，且B23-1葉面存在瘤狀突起。

圖3 500倍SEM視野下各樣本葉表微觀結(jié)構(gòu)注：圖中字母與數(shù)字組合為各無(wú)性系的編號(hào)，上下分別表示葉片上表皮與下表皮。Fig.3 SEM of micro-configurations of leaf epidermis for R.pseudoacacia f.unifolia and its different hybrid progenies(500×)

進(jìn)一步分析各樣本的氣孔器形態(tài)、氣孔數(shù)量、表皮毛數(shù)量(表2)可知，各樣本的氣孔形狀無(wú)較大差異，均為圓形，且排列均不整齊。從氣孔大小來看，除子代B23-1、C23-1外，母本及其余子代的氣孔大小均不統(tǒng)一。從氣孔的開閉程度來看，各樣本間均存在差異，其中子代C24-1的氣孔幾乎均開放，但A20-5、B24-3、B23-1的氣孔幾乎均關(guān)閉。從氣孔數(shù)量來看，母本與其余樣本相比，氣孔數(shù)量最多，且少部分保衛(wèi)細(xì)胞存在突起。母本及各子代葉表均有表皮毛，但密度存在差異，其中B23-1的表皮毛數(shù)量最多，在500倍視野下為8根，母本、子代B24-3及C24-2表皮毛數(shù)量最少，均為1根。

表2 各樣本葉表皮氣孔及表皮毛特征(500倍視野下)Tab.2 The characteristics of leaf epidermis stomata and epidermis of all clones tested(500×)

2.3 葉形及葉表SEM特征與滯塵指標(biāo)的關(guān)系

為進(jìn)一步探討單葉刺槐及各半同胞子代的葉表滯塵機(jī)制，將葉形及葉表SEM指標(biāo)、各滯塵指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)經(jīng)無(wú)量綱化處理后，進(jìn)行相關(guān)性分析，篩選與滯塵能力顯著相關(guān)的葉形、SEM指標(biāo)(表3)。結(jié)果表明小葉面積與單位葉面積總滯塵量呈顯著正相關(guān)(r=0.816)，說明小葉面積越大，各樣本對(duì)空氣中總顆粒物的滯留能力越強(qiáng)。氣孔的開閉程度與PM2.5的滯留能力呈極顯著正相關(guān)(r=0.957)，說明氣孔的開放程度越高，對(duì)于空氣中PM2.5的滯留效果也就越好。表皮毛數(shù)量與單位葉面積總滯塵量呈顯著正相關(guān)(r=0.847)，與PM2.5的滯留能力呈極顯著正相關(guān)(r=0.978)，說明表皮毛的密度顯著影響了各樣本對(duì)空氣中總顆粒物及PM2.5的滯留效果。葉面粗糙程度與單位葉面積總滯塵量極顯著正相關(guān)(r=0.923)，與其余滯塵指標(biāo)均呈顯著正相關(guān)，說明葉面粗糙程度對(duì)葉表滯塵能力的影響最大，且葉面越粗糙，滯塵能力越強(qiáng)。

表3 葉形及葉表SEM特征與各滯塵指標(biāo)的關(guān)系Tab.3 Relationship between leaf shape and SEM characteristics of leaf surface and dust retention indexes

2.4 滯塵能力綜合評(píng)價(jià)

依據(jù)單一滯塵指標(biāo)無(wú)法客觀全面的反映樣本滯塵能力的強(qiáng)弱，運(yùn)用隸屬函數(shù)法，以5個(gè)滯塵指標(biāo)及與其相關(guān)性顯著的葉形指標(biāo)(除氣孔開閉程度指標(biāo)，因?yàn)榇酥笜?biāo)受光照、溫度等因素影響較大)的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)為依據(jù)，計(jì)算各指標(biāo)的隸屬度，并求各樣本的隸屬度均值，均值越大，其葉表滯塵能力越強(qiáng)。如表4所示，7個(gè)樣本按綜合滯塵能力強(qiáng)弱排序?yàn)椋築23-1、C24-1、A1-1、A20-5、C23-1、C24-2、B24-3。

表4 各樣本滯塵指標(biāo)隸屬度值Tab.4 Membership value of dust retention index of each sample

進(jìn)一步以各樣本的隸屬度均值為依據(jù)進(jìn)行聚類分析(圖4)，當(dāng)類間最短距離為5時(shí)，可按滯塵能力強(qiáng)弱將全部樣本分為4類，第I類為B23-1，滯塵能力強(qiáng)；第Ⅱ類為C24-1，滯塵能力較強(qiáng)；第Ⅲ類包括A1-1、A20-5、C23-1、C24-2，滯塵能力中等；第Ⅳ類為B24-3，滯塵能力相對(duì)較差。

圖4 單葉刺槐及其不同子代滯塵能力聚類分析注：圖中字母與數(shù)字組合為各無(wú)性系的編號(hào)。Fig.4 Cluster analysis of dust retention ability of R.pseudoacacia f.unifolia and its different hybrid progenies

3 討論與結(jié)論

根據(jù)近5 a的河北省環(huán)境質(zhì)量公報(bào)，本試驗(yàn)所在的河北省保定市全年環(huán)境空氣質(zhì)量達(dá)國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的天數(shù)不足60%，空氣污染程度始終位列全國(guó)前十名，雖達(dá)標(biāo)天數(shù)逐年增加，但空氣質(zhì)量狀況仍不容樂觀。而植物葉片對(duì)大氣顆粒污染物有明顯的滯留效果，不同樹種間的滯塵能力可達(dá)40倍以上[16-18]。因此合理選擇滯塵樹種，對(duì)改善空氣質(zhì)量，提高人民的幸福感具有重要意義。

本研究表明，供試無(wú)性系的單位葉面積總顆粒物滯留量均值為55.85 μg/cm2，高于大葉黃楊(Buxusmegistophylla)、白蠟(Fraxinuschinensis)、元寶楓(Acertruncatum)等北方常見綠化樹種[10]，說明單葉刺槐的整體滯塵能力較為優(yōu)秀。原因可能是由于樹種間葉表微觀結(jié)構(gòu)存在差異，單葉刺槐各參試無(wú)性系的葉表均有表皮毛結(jié)構(gòu)，提高了單葉刺槐單位葉面積對(duì)顆粒物的滯留量，而上述樹種均無(wú)此葉表結(jié)構(gòu)，也有可能是由于采樣月份、采樣地域的空氣質(zhì)量狀況不同所導(dǎo)致。運(yùn)用激光粒度儀對(duì)總顆粒物進(jìn)行粒度分析，結(jié)果表明各樣本吸附的顆粒物粒徑主要分布在PM10(D≤10μm)以內(nèi)，各樣本滯留PM2.5、PM2.5-10、PM>10的能力存在差異。這與Wang等[19]、Tomaevi等[20]的研究結(jié)論一致，與張桐等[10]得出的北京市6種植物葉表滯留顆粒物粒徑主要分布在10～50 μm的結(jié)論不同，原因可能是由于樹種之間存在差異，也有可能是由于采樣時(shí)間的不同導(dǎo)致的。運(yùn)用SEM法觀察各樣本的葉表微觀特征，結(jié)果表明部分子代在微觀結(jié)構(gòu)上與母本相比產(chǎn)生了明顯變異，這也進(jìn)一步體現(xiàn)了在雜交育種的過程中微觀結(jié)構(gòu)的性狀分離[21]。將各葉形及SEM指標(biāo)與滯塵指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明小葉面積、表皮毛數(shù)量與單位葉面積總滯塵量顯著相關(guān)，氣孔的開閉程度、表皮毛數(shù)量與PM2.5的滯留能力顯著相關(guān)，葉面粗糙程度與各滯塵指標(biāo)均顯著相關(guān)，從微觀角度解釋了各樣本間滯塵指標(biāo)存在差異的原因。這與張俊葉等[11]、魯紹偉等[22]眾多學(xué)者的研究結(jié)論相似，與王琴等[9]對(duì)武漢市15種綠化植物滯塵能力研究得出的氣孔大小與滯塵能力無(wú)關(guān)的結(jié)論不同，原因可能是氣孔開放程度越大，細(xì)小的顆粒物越容易吸附在氣孔內(nèi)壁，也有可能是兩地氣候條件的不同或樹種的不同導(dǎo)致的。進(jìn)一步利用隸屬函數(shù)法、聚類分析法對(duì)7個(gè)樣本的滯塵能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明僅子代B23-1、C24-1的綜合滯塵能力優(yōu)于母本，原因可能是由于本試驗(yàn)材料為2019年嫁接，生長(zhǎng)時(shí)間僅1 a，部分優(yōu)勢(shì)性狀還未完全體現(xiàn)。

本研究表明，單葉刺槐及各子代的滯塵能力較為優(yōu)秀，可作為園林滯塵樹種在我國(guó)北方大規(guī)模推廣。利用葉形及SEM指標(biāo)，可對(duì)樣本間滯塵能力的差異作出有效解釋。子代B23-1的滯塵能力最強(qiáng)，C24-1對(duì)PM2.5的吸附能力最強(qiáng)，A20-5對(duì)PM2.5-10及PM>10的吸附能力最強(qiáng)，但大部分子代的雜種優(yōu)勢(shì)并未完全體現(xiàn)，還有待進(jìn)一步培育優(yōu)化。