熱毒寧口服液質量標準研究*

任 瑩，李大剛，王 虎，劉 靜，張宗鵬△

（1.安徽省太和縣中醫(yī)院，安徽 阜陽 236600；2.天津藥物研究院有限公司，天津 300193）

熱毒寧口服液是省級名中醫(yī)丁超主任醫(yī)師根據(jù)中 醫(yī)理論制訂的臨床經(jīng)驗方，用于治療風溫肺熱病風邪犯肺證，療效顯著[1]。其由金銀花、連翹、大青葉等6味藥材組方，具有清熱解毒、調和營衛(wèi)、辛涼透表、益氣和胃功效，主治高熱煩躁、高熱抽搐、頭痛身痛、急性咽炎、扁桃體炎、流感肺炎等。方中連翹為君藥，清熱解毒，消腫散結，疏散風熱?，F(xiàn)代藥理研究表明，連翹苷具有顯著的抑菌和抗炎活性[2-3]，能抑制小膠質細胞活化產(chǎn)生的炎性反應[4]，通過抑制肝細胞的凋亡在酒精性肝損傷中發(fā)揮保護作用[5]，故優(yōu)選連翹飲片的含量成分連翹苷作為質量控制指標。本研究中對處方各藥味進行了定性鑒別，建立了熱毒寧口服液中金銀花、大青葉、柴胡、甘草的薄層鑒別方法及測定連翹苷含量的高效液相色譜（HPLC）法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-40D型高效液相色譜儀（PDA極管陣列檢測器，株式會社島津研究所）；Ultimate3000型高效液相色譜儀（紫外檢測器，賽默飛世爾科技有限公司）；XSE105DU型分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為十萬分之一）；KQ-300DE型超聲清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；ZF-2型三用紫外分析儀（上海安亭電子儀器廠）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號為110753-201817，純度為96.8%），靛玉紅對照品（批號為110717-201805，純度為99.6%），柴胡對照藥材（批號為120992-201509），連翹苷對照品（批號為 110821-201816，純度為95.1% ），甘草對照藥材（批號為 120904-201620），均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈、甲醇均為色譜純（美國天地有限公司）；水為超純水，其余試劑為分析純；熱毒寧口服液（太和縣中醫(yī)院醫(yī)院制劑，批號分別為20042001，20042201，20042401）；缺味陰性樣品由實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜定性鑒別

金銀花[6-9]：取樣品溶液 1 mL，加乙醇 2 mL[7]544，搖勻，作為供試品溶液。按樣品制備工藝制備缺金銀花的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺金銀花的陰性對照品溶液。另取綠原酸對照品，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述溶液各1～2 μL，點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸（8 ∶1 ∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與綠原酸對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

大青葉[10-11]：取樣品溶液20 mL，加乙醚提取2次，每次20 mL，保存水液，待用，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。再按樣品制備工藝制備缺大青葉的陰性樣品，按前述方法平行制備缺大青葉的陰性對照品溶液。取靛玉紅對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷 -乙酸乙酯（3∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

1.對照品溶液 2.陰性對照品溶液 3-5.供試品溶液 6.對照藥材溶液A.金銀花 B.大青葉 C.柴胡 D.甘草圖1 薄層色譜圖1.reference solution 2.negative reference solution 3-5.test solution 6.reference material solutionA.Flos Lonicerae B.Folium Isatidis C.Radix Bupleuri D.Radix GlycyrrhizaeFig.1 TLC chromatograms

柴胡[12]：取上述大青葉鑒別項下的水液，用水飽和正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液40 mL清洗1次，棄去氨試液，再以正丁醇飽和水洗2次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。再按樣品制備工藝制備缺柴胡的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺柴胡的陰性對照品溶液。取柴胡對照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，超聲處理（功率為 300 W，頻率為 40 kHz）10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為對照藥材溶液。分別吸取上述溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯 -乙醇 -水（12∶2∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，60℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。甘草：取樣品溶液30 mL，加乙醚提取2次，每次30 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。再按樣品制備工藝制備缺甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺甘草的陰性對照品溶液。取甘草對照藥材1 g，加甲醇80 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，加水40mL使溶解，用乙酸乙酯提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。分別吸取上述對照藥材溶液 5 μL，供試品溶液、陰性對照品溶液各 10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15 ∶1 ∶1 ∶2，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 D。

2.2 高效液相色譜法測定連翹苷含量

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：島津 WondaCract ODS-2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -水（30 ∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：277 nm；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按連翹苷峰計不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

取連翹苷對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度為每1 mL含26 μg的溶液，即得對照品溶液。精密量取樣品溶液2 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取濾液，即得供試品溶液。按熱毒寧口服液的制備工藝制備缺連翹的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備缺連翹的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

陰性干擾試驗：精密吸取2.2.2項下溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定。結果供試品溶液中的連翹苷峰分離度良好，陰性對照品溶液色譜中未見連翹苷干擾峰。詳見圖2。

A.供試品溶液 B.對照品溶液 C.陰性對照品溶液圖2 高效液相色譜圖A.Test solution B.Reference solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取質量濃度為0.442 mg/mL的對照品溶液，用甲醇逐級稀釋成0.221 0，0.044 2，0.026 52，0.013 26，0.006 63 mg/mL 系列質量濃度的連翹苷對照品溶液，精密吸取上述對照品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以連翹苷的峰面積（X）為橫坐標、質量濃度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y=1.350 4 × 10-7X-0.000 929 25，r=0.999 99（n=5）。結果表明，連翹苷質量濃度在0.00663～0.22100mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取質量濃度為26.52 μg/mL的同一對照品溶液適量，連續(xù)進樣5次。結果連翹苷峰面積的RSD為0.96%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為20042401）6份，依法制備供試品溶液，分別進樣測定。結果連翹苷峰面積的RSD為1.80%（n=6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為20042401），依法制備供試品溶液，于配制后 0，2，4，8，12，24 h 時分別精密進樣10 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。結果連翹苷峰面積的 RSD為1.90%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量為0.6636mg/mL的樣品9份，各1 mL，平行 3份，3個水平，按75%，100%，125%濃度分別加入連翹苷對照品，依法制備供試品溶液，分別進樣10 μL，按2.2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，每批次平行制備2份，按2.2.1項下色譜條件測定。結果批號為20042001，20042201，20042401的樣品中連翹苷含量分別為 0.579 3，0.554 6，0.651 1 mg/mL（n=2）。

3 討論

3.1 薄層鑒別

金銀花素有中藥中的抗生素之美譽[13]，具有清熱解毒、疏散風熱之功效，用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發(fā)熱。現(xiàn)代藥理學研究表明，金銀花提取物及其所含的化學成分具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝、抗腫瘤等多種藥理活性[14]。常規(guī)治療基礎上加用金銀花口服液，可顯著改善新型冠狀病毒肺炎患者發(fā)熱、乏力、咳嗽的癥狀，減輕肺部病變，改善呼吸功能，對病毒核酸轉陰也顯示出良好的改善趨勢[15]。方中大青葉有良好的抗病毒活性，對甲型流感病毒、乙型腦炎病毒、腮腺炎病毒等均有很好的抑制作用[16]；柴胡性涼，味苦，入肝膽經(jīng)，用于治療寒熱往來、胸滿肋痛、口苦耳聾等證，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、降溫、鎮(zhèn)咳、抗炎、保肝、抗腫瘤、降血壓、抑制由組胺和5-羥色胺引起的血管通透性增加等作用[17]；甘草性平，味甘，補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，具有增強免疫及抗炎作用[18-19]。

表1 連翹苷加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of recovery tests of phillyrin（n=9）

3.2 色譜條件優(yōu)化

熱毒寧口服液中連翹苷的含量測定依據(jù)2015年版《中國藥典（一部）》[7]170和文獻[20-22]中連翹的含量測定方法，適當調整，最終確定了測定連翹苷含量的色譜條件。首先，進行全波長掃描，取連翹苷對照品溶液注入高效液相色譜儀（PDA檢測器）檢測，記錄連翹苷的色譜圖，結合參考文獻，將檢測波長定為277 nm。并在此基礎上對柱溫（25，30，35 ℃）、流速（0.9，1.0，1.1 mL/min）、色譜柱（大連依利特、賽默飛、島津）、不同比例流動相進行了考察，結果顯示該方法用于測定熱毒寧口服液中連翹苷的含量耐用性好。

3.3 方法評價

本研究中建立的熱毒寧口服液中金銀花、柴胡、大青葉、甘草的薄層鑒別方法和測定連翹苷含量的高效液相色譜法，專屬性、耐用性、重復性、準確性均較好，可為熱毒寧口服液的質量控制提供依據(jù)。