高血壓及高血壓合并糖尿病的患者血漿可溶性NRP-1與SOD濃度的變化

余舒杰，劉定輝，宋志明，錢孝賢，3

（1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣東廣州 510630；2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南開封 475001；3.中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東廣州 510630）

血管生成（angiogenesis）是胚胎期血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)育、器官生長、組織修復(fù)和血管重塑等過程的必經(jīng)步驟，在這一過程中多種細(xì)胞因子發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endotheli?al growth factor，VEGF）及其受體血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1（vascular endothelial growth factor recep?tor 1，VEGFR1）/血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（vas?cular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）和神經(jīng)纖毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP-1）等［1］。NRP-1 是一個分子量為120～130 ku 的Ⅰ型單次跨膜糖蛋白，由一個多結(jié)構(gòu)域胞外區(qū)、一個跨膜螺旋和一個胞質(zhì)區(qū)3部分組成［2］。NRP-1最初在青蛙的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，它是一種多功能的跨膜糖蛋白，無論在生理或者病理條件下它都可作為多種生長因子或其他配體的共受體而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，它在神經(jīng)、血管、腫瘤和免疫等系統(tǒng)都發(fā)揮著重要作用［3-5］。NRP-1 在新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞上持續(xù)高表達(dá)，作為VEGF 的同工型VEGF165 的共受體能夠通過VFGFR2 在血管生成的過程中加強靶細(xì)胞的遷移，誘導(dǎo)血管增生，對血管形態(tài)的形成至關(guān)重要，因此它在心血管系統(tǒng)發(fā)育過程中起著重要作用［6］。但是既往研究發(fā)現(xiàn)，NRP-1 蛋白在糖尿病患者腎組織中的表達(dá)明顯減少［7］。目前可溶性NRP-1 在糖尿病和高血壓患者血漿中的濃度尚不十分清楚。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）作為一種抗氧化劑，能清除生物體內(nèi)活性氧自由基，是機體氧化應(yīng)激的主要生物分子。眾所周知，糖尿病和（或）高血壓患者機體內(nèi)都存在過度的氧化應(yīng)激，所以其血漿SOD的活性可能會有所改變，但其變化的趨勢目前尚有爭議［8］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，高血壓及高血壓合并糖尿病患者的血漿可溶性VEGFR2 水平較健康對照組均顯著降低，且與SOD 呈正相關(guān)［9］。NRP-1 作為VEGFR2的共受體，兩者關(guān)系密切且能發(fā)生相互作用，共同發(fā)揮調(diào)控血管增生的作用［10］。因此，本研究旨在觀察高血壓及高血壓合并糖尿病患者的血漿可溶性NRP-1 的濃度和SOD 活性的變化，并進一步探討兩者的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 目標(biāo)人群分組及排除標(biāo)準(zhǔn)

整體人群來源于2012年12月至2013年1月來我院體檢的石牌村村民。從該體檢人群選取88 人作為研究對象，將其分為3 組：正常對照組（n=26），高血壓組（n=31）和高血壓合并糖尿病組（n=31）。正常對照組為目前和既往均沒有診斷高血壓和（或）糖尿病的健康人群?！吨袊哐獕悍乐沃改?010》的高血壓定義為：在未服用降壓藥物的情況下，非同日3次測量血壓，收縮壓≥140 mmHg和（或）舒張壓≥90 mmHg［11］。該研究的高血壓人群嚴(yán)格按照該指南的高血壓定義入選。《中國2型糖尿病防治指南2013》糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：①多尿、煩渴多飲和難于解釋的體質(zhì)量減輕的糖尿病癥狀加隨機血糖≥11.1 mmol/L 或②空腹血糖≥7.0 mmol/L或③口服葡萄糖耐量試驗2 h血糖≥11.1 mmol/L［12］。本研究的糖尿病人群嚴(yán)格按照該指南的2 型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)入選。同時3 組研究人群的排除標(biāo)準(zhǔn)為：目前有肝腎功能異常的人群；正在服用降壓、降糖及調(diào)脂藥物的人群；存在不穩(wěn)定心血管疾病人群（如不穩(wěn)定心絞痛、有過心肌梗死病史、充血性心力衰竭等）；有腦血管疾病的人群；體檢發(fā)現(xiàn)腫瘤或有腫瘤病史的人群；本次體檢資料不完整的人群。本研究獲得中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 血標(biāo)本的準(zhǔn)備與測定

經(jīng)外周靜脈抽取血標(biāo)本10 mL，等分于干燥管和抗凝管中，干燥管中的血標(biāo)本用于常規(guī)生化檢查。血脂檢測利用7180A 型全自動生化分析儀（日立）檢測；采用葡萄糖氧化酶法進行血漿葡萄糖測定，試劑購于保定長城臨床試劑有限公司，通過分光光度分析法（上海精密科學(xué)儀器有限公司721 分光光度儀）分析數(shù)據(jù)；糖化血紅蛋白用離子交換高效液相色譜法測定，儀器為美國Bio-Rad公司D-10。血標(biāo)本收集到抗凝管中，以3 000 r/min（r=50 cm）離心10 min 后吸取上清液，分裝保存于-80 ℃冰箱以供后續(xù)使用。3組人群血漿的可溶性NRP-1 的濃度和SOD 的活性經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）測定，檢測試劑盒均購自英國艾博抗（Abcam）公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。服從正態(tài)分布的連續(xù)性資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），通過LSD-test 進行均數(shù)的兩兩比較。非正態(tài)分布的連續(xù)變量以中位數(shù)和四分位數(shù)，即P50（P25～P75）表示，多組比較采用Kruskal WallisH檢驗。分類變量采用數(shù)字和率表示，其組間比較采用卡方檢驗。分別繪制三組研究數(shù)據(jù)的散點圖，并分別計算簡單線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）計算。P<0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究人群的臨床和生化指標(biāo)的變化

本研究選取88 人，分為正常對照組（n=26）、高血壓組（n=31）以及高血壓合并糖尿病組（n=31）等3 組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純高血壓組血清總膽固醇（total cholesterol，TC）和體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）較對照組顯著性升高（P<0.05）；而高血壓合并糖尿病組血清TC、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）、BMI 和腰圍（waist circumfer?ence，WC）均較對照組明顯升高（P<0.05）。單純高血壓組和高血壓合并糖尿病組血漿可溶性NRP-1的濃度和SOD 的活性均較對照組顯著性降低（P<0.05），而高血壓合并糖尿病組較單純高血壓組血漿可溶性NRP-1 的濃度和SOD 的活性更低（P<0.05），且差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.2 研究人群血漿可溶性NRP-1 濃度與SOD 的相關(guān)情況

將研究人群分為正常對照組（n=26）、高血壓組（n=31）以及高血壓合并糖尿病組（n=31）等3 組，應(yīng)用各組人群的血漿可溶性NRP-1 濃度與SOD 的數(shù)據(jù)分別繪制散點圖，并分別計算其簡單線性回歸方程（圖1）。對3 組研究人群進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，可溶性NRP-1 的濃度與SOD 的活性之間均呈顯著性正相關(guān)（P<0.05，表2）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)正常對照組人群血漿可溶性NRP-1的濃度為7.7～10.0 ng/mL，而國內(nèi)有研究報道健康成年人血清NRP-1 的濃度為8.7～9.9 ng/mL，這與我們的研究結(jié)果基本相符［13］。我們的研究人群分為正常對照組（26 人）、高血壓組（31 人）及高血壓合并糖尿病組（31 人），結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純高血壓組和高血壓合并糖尿病組患者血漿可溶性NRP-1 濃度均較對照組顯著減低，而高血壓合并糖尿病組患者血漿可溶性NRP-1 濃度較單純高血壓組更低。眾所周知，糖尿病患者血管新生能力與健康人群相比明顯下降，本研究結(jié)果說明糖尿病合并高血壓患者血漿中可溶性NRP-1 濃度的下降可能是導(dǎo)致糖尿病患者血管生成功能紊亂的又一個重要機制。既往對肥胖糖尿病小鼠的肌肉組織研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，Stephan等［14］研究發(fā)現(xiàn)肥胖糖尿病小鼠的肌肉組織的NRP-1 表達(dá)水平較非糖尿病小鼠顯著下降，這可能是糖尿病小鼠血管生成能力損害的一個機制。而Kivel? 等［15］研究也發(fā)現(xiàn)1 型糖尿病小鼠肌肉組織NRP-1 mRNA 表達(dá)水平較對照組小鼠顯著下降，同時伴有骨骼肌血管生成能力的損害，且運動訓(xùn)練可以逆轉(zhuǎn)小鼠肌肉組織表達(dá)NRP-1 mRNA水平下降的作用。我們研究已發(fā)現(xiàn)高血壓及高血壓合并糖尿病患者的血漿可溶性VEGFR2 水平較健康對照組降低，而NRP-1 可通過強化VEGFR2與VEGF165結(jié)合而促進血管生成，所以NRP-1 和VEGFR2 兩者關(guān)系密切［9，16］。在高血壓及高血壓合并糖尿病患者中，本研究也發(fā)現(xiàn)血漿可溶性NRP-1濃度均低于對照組。血漿可溶性NRP-1 可能是多種組織器官如心、肺、肝等的內(nèi)皮細(xì)胞NRP-1 蛋白細(xì)胞外域脫落的產(chǎn)物［17］，而患者血漿較組織或細(xì)胞更易方便獲得，所以血漿可溶性NRP-1 水平可作為機體組織或細(xì)胞NRP-1 蛋白表達(dá)水平的間接反映。有研究發(fā)現(xiàn)，它可能通過拮抗VEGF165而發(fā)揮抑制血管生成作用［18］，所以本研究發(fā)現(xiàn)在高血壓和高血壓合并糖尿病患者血漿可溶性NRP-1 濃度降低可能是血壓升高的一個機制［19］。

表1 研究人群的臨床和生化指標(biāo)一覽表Table 1 Clinical and biochemical parameters of the whole group.

圖1 三組研究人群血漿中neuropilin-1濃度與SOD的散點圖和簡單線性回歸方程Fig.1 Scattergram and simple linear regression equation of plasma neuropilin-1 concentration and SOD in three study groups

表2 三組研究人群血漿中neuropilin-1濃度與SOD的相關(guān)情況Table 2 Correlation between plasma neuropilin-1 con?centration and SOD in three studies

Ceriello 教授提出“共同土壤學(xué)說”，認(rèn)為氧化應(yīng)激是胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)［20-21］。眾所周知，SOD 是一種抗氧化劑，它能清除有害的活性氧自由基，在氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮著重要作用。而本研究也發(fā)現(xiàn)，血漿SOD的活性在單純高血壓和高血壓合并糖尿病患者中均較正常對照組降低，且高血壓合并糖尿病患者較單純高血壓患者更低。國內(nèi)臨床研究也有類似發(fā)現(xiàn)，他們研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性高血壓和合并糖耐量減低患者血漿SOD 活性都較對照組降低［22］。最新國內(nèi)研究也報道，高血壓患者血清SOD 的活性較對照組下降，而且SOD的活性與高血壓分級呈負(fù)相關(guān)［23］。也有動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠主動脈組織的VEGFR2 蛋白表達(dá)減少，其中氧化應(yīng)激起著重要作用［24］。而我們的研究也發(fā)現(xiàn)，高血壓及合并糖尿病患者的血漿可溶性VEGFR2水平較對照組降低，且與SOD 的活性有正相關(guān)性［9］。既往多項研究證實NRP-1和VEGFR2二者關(guān)系密切，共同調(diào)節(jié)血管生成［10，16，25］。所以在本研究人群中發(fā)現(xiàn)血漿可溶性NRP-1 的濃度與SOD 的活性存在正相關(guān)，這提示高血壓和高血壓合并糖尿病患者血漿NRP-1 濃度降低可能與相應(yīng)的SOD 活性降低有關(guān)。高血壓和高血壓合并糖尿病患者的血漿SOD 活性下降提示機體內(nèi)存在過度的氧化應(yīng)激，而NRP-1 在血管生成過程中具有重要作用，所以血漿SOD的活性與可溶性NRP-1 的濃度正相關(guān)性表明過度氧化應(yīng)激與血管生成功能紊亂可能存在一定的聯(lián)系。

我們的研究發(fā)現(xiàn)高血壓和高血壓合并糖尿病患者血漿可溶性NRP-1 的濃度均較正常對照組低，而NRP-1 在血管生成過程中具有重要作用，所以血漿可溶性NRP-1 濃度的降低可能是高血壓和高血壓合并糖尿病患者機體血管生成功能紊亂的一個重要生物學(xué)標(biāo)志，而且血漿SOD 活性的下降可能是其中的一個重要機制，但是有關(guān)NRP-1與氧化應(yīng)激相互作用的具體機制有待于進一步研究探討。由于該研究樣本量偏小，所以目前所得研究結(jié)果還需經(jīng)擴大樣本量的臨床研究來進一步證實。