被α-synuclein激活的小膠質(zhì)細(xì)胞通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)miR-19a-3p抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬

林 輝，劉思齊，黃云苑，周天恩

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，廣東廣州 510640；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院急診科，廣東廣州 510120；3.中山大學(xué)附屬佛山醫(yī)院急診科，廣東佛山，528000）

過表達(dá)的α-突觸蛋白（α-synuclein，SNCA）以及其在多巴胺能神經(jīng)元中的聚集、沉積是帕金森?。≒arkinson's disease，PD）發(fā)病機(jī)制中的重要因素。我們之前研究發(fā)現(xiàn)［1］，過表達(dá)SNCA 的神經(jīng)細(xì)胞外泌體可被小膠質(zhì)細(xì)胞攝取，并通過miRNA-19a-3p調(diào)控PTEN 通路，進(jìn)而抑制受體小膠質(zhì)細(xì)胞自噬。然而小膠質(zhì)細(xì)胞自噬被抑制后重新分泌的外泌體的miRNAs 成分及功能變化尚不清楚。我們研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞自噬被抑制后重新分泌的外泌體也可以再次被神經(jīng)細(xì)胞攝取，然而這部分外泌體對(duì)神經(jīng)元自噬功能的影響亦不清楚。本文主要研究了被過表達(dá)SNCA 的SH-SY5Y 細(xì)胞外泌體刺激后的小膠質(zhì)細(xì)胞重新分泌的外泌體（SNCA-HM Exo）的miRNAs 成分變化，以及其對(duì)受體神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y 細(xì)胞，武漢普諾賽生命科技有限公司），人小膠質(zhì)細(xì)胞（Human microglia，HM，上海斯信生物科技有限公司），LC3抗體（美國(guó)CST 公司），P62 抗體（日本mbl 公司），GAPDH 抗體（美國(guó)Abcam 公司），HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（美國(guó)Abcam 公司），HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗（美國(guó)Abcam 公司），M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Promega公司），GoTaq?qPCR Master Mix（美國(guó)Promega 公司），miRCURYTM Array microarray kit（丹麥Exiqon公司），Hybridization Chamber II（美國(guó)Corning 公司），BioarrayLifterSlip coverslip（美 國(guó)Ambion 公司），miRCURYTM Array Labelling kit（丹麥Exiqon公司），RNeasy Mini Kit（德國(guó)Qiagen 公司），PTEN抗體（美國(guó)Abcam公司），Akt抗體（美國(guó)CST公司），p-Akt 抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司），mTOR 抗體（美國(guó)Abcam 公司），p-mTOR 抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司），hsa-miR-19a-3p mimic（廣州市銳博生物科技有限公司），hsa-miR-19a-3p inhibitor（廣州市銳博生物科技有限公司）。

1.2 小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及外泌體分離

復(fù)蘇并培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞（human microglia，HM），以1×106細(xì)胞數(shù)接種于10 cm 培養(yǎng)皿中，先培養(yǎng)24 h。分為兩組，Con-Exo HM 組：在HM 中加入過表達(dá)GFP-con 的SH-SY5Y 細(xì)胞外泌體（約1×108微粒數(shù)）；SNCA-Exo HM 組：在HM 中加入過表達(dá)GFP-SNCA 的SH-SY5Y 細(xì)胞外泌體（約1×108微粒數(shù)），培養(yǎng)24 h后換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集上清液，采用超速梯度離心的方法分離外泌體，具體離心方法詳見我們既往發(fā)表的文章［2］。Con-Exo HM 分泌的外泌體簡(jiǎn)稱為Con-HM Exo，SNCA-Exo HM 分泌的外泌體簡(jiǎn)稱為SNCA-HM Exo。收集分離的外泌體送NTA 分析，結(jié)果顯示Con-HM Exo 粒子濃度為0.923×108（particles/mL），SNCA-HM Exo粒子濃度為0.873×108（particles/mL）。

1.3 小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體負(fù)染色后電鏡鑒定

滴加20 μL 外泌體懸液于載樣銅網(wǎng)上，在室溫條件下靜置1 min，用濾紙從背面吸干液體，滴加2%磷鎢酸溶液（pH 6.8）20 μL 于銅網(wǎng)上，室溫下負(fù)染色1 min。用濾紙吸干負(fù)染液，在白熾燈下烘干10 min，置于于200 kv透射電鏡下觀察。

1.4 外泌體miRNAs芯片分析

外泌體超速離心收集后，加0.25 mL TRIZOL充分裂解，加入氯仿兩相分離，收集水相，加入異丙醇沉淀RNA，乙醇清洗。RNA 質(zhì)量檢測(cè)后應(yīng)用NanoDrop?ND-1000 進(jìn)行RNA 濃度和純度檢測(cè)。應(yīng)用miRCURYTM Array Labelling kit 進(jìn)行miRNAs標(biāo)記。采用RNeasy Mini Kit 濃縮RNA，之后應(yīng)用miRCURYTM Array microarray kit 進(jìn) 行miRNAs 芯片雜交。最后使用Genepix 4000B 掃描芯片圖像，并采用Genepix Pro 6.0軟件分析。

1.5 miR-19a-3p 模擬物（miR-19a-3p mimic）及抑制劑（miR-19a-3p inhibitor）轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞

在每個(gè)6孔板中接種1×105SH-SY5Y細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染前換液，每孔加入培養(yǎng)液2 mL，miR-19a-3p 模擬物及抑制劑的轉(zhuǎn)染濃度均為100 nmol/L。分別用120 μL 1×Buffer 稀釋10 μL 20 μmol/L 的miR-19a-3p 模擬物及抑制劑，搖勻后分別加入12 μL Reagent 混勻，在室溫條件下孵育10 min 后分別加入每孔含2 mL 培養(yǎng)液的6 孔板中。共同培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞，采用PCR 方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的效率。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組

每個(gè)6 孔板中接種1×105SH-SY5Y 細(xì)胞，分為4組，具體如下：

Con-HM Exo 組：Con-HM Exo（約1×108微粒數(shù)）與SH-SY5Y細(xì)胞共培養(yǎng)48 h。

Con-HM Exo+miR-19a mimic 組：miR-19a-3p模擬物轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞后，加入Con-HM Exo（約1×108微粒數(shù)）共培養(yǎng)48 h。

SNCA-HM Exo 組：SNCA-HM Exo（約1×108微粒數(shù)）與SH-SY5Y細(xì)胞共培養(yǎng)48 h。

SNCA-HM Exo+miR-19a-3p inhibitor 組：miR-19a-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞后，加入SN?CA-HM Exo（約1×108微粒數(shù)）共培養(yǎng)48 h。

1.7 Western Blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平

收集SH-SY5Y 細(xì)胞，提取蛋白后采用凝膠電泳方法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。蛋白電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，然后封閉非特異性抗原，之后加入相應(yīng)的一抗P62（MBL，PM045，1∶1 000），LC3（CST，CST3862，1∶1 000），PTEN（Abcam，ab32199，1：1 000），p-Akt（Santa Cruz，sc-81433，1∶1 000），Akt（CST，#9272，1∶1 000），p-mTOR（Santa Cruz，sc-101738，1∶1 000），mTOR（Abcam，ab2732，1∶1 000），4 ℃條件下震蕩孵育，第2 天采用TBST 洗滌后分別加入羊抗鼠二抗（Abcam，ab6808，1∶5 000）或羊抗兔二抗（CST，#7054，1∶5 000），繼續(xù)在室溫條件下震蕩孵育50 min后TBST洗滌三次，最后加入顯影劑曝光顯影。采用Image J 軟件分析蛋白條帶的光密度值。以GAPDH（Ab?cam，ab70699，1∶5 000）作為內(nèi)參，比較各組細(xì)胞蛋白表達(dá)的差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)用±s表示，兩個(gè)獨(dú)立樣本定量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組間定量數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)，采用Kruskal WallisH檢驗(yàn)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較。當(dāng)P<0.05 時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體透視電鏡鑒定

小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體負(fù)染色后，透視電鏡下可見直徑大約40～100 nm 的囊泡，其大小及形狀特征與外泌體相符（圖1）。

圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體透視電鏡鑒定Fig.1 Identification of microglia exosomes by electron microscope

2.2 不同組別之間外泌體存在差異表達(dá)的miRNAs

為研究被過表達(dá)α-synuclein的SH-SY5Y細(xì)胞外泌體刺激的HM 再次分泌的外泌體（SNCA-HM Exo）是否能通過miRNAs 調(diào)控受體神經(jīng)細(xì)胞的自噬功能，我們對(duì)這些HM 外泌體內(nèi)含的miRNAs 進(jìn)行芯片分析。結(jié)果顯示，被過表達(dá)α-synuclein 的SH-SY5Y 細(xì)胞外泌體以及對(duì)照組外泌體分別刺激的HM 分泌的外泌體中存在表達(dá)差異2 倍以上的miRNAs，我們篩選出差異表達(dá)最顯著的20 個(gè)miR?NAs，其中表達(dá)上調(diào)與表達(dá)下調(diào)的miRNAs 各10 個(gè)（表1），因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)芯片分析僅作為初篩，所以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的樣本量均為1。為了驗(yàn)證芯片分析數(shù)據(jù)的可靠性，我們接著應(yīng)用PCR對(duì)芯片分析初步篩選出的這20個(gè)miRNAs 進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最后確認(rèn)其中15 個(gè)miRNAs 存在表達(dá)差異，其中7 個(gè)miRNAs 表達(dá)上調(diào)，8 個(gè)miRNAs 表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖2）。我們應(yīng)用TargetscanHuman 7.1 及miRDBV5 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)對(duì)這15個(gè)miRNAs 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示差異表達(dá)的15個(gè)miRNAs的靶基因共有1 457個(gè)。

2.3 差異表達(dá)的miRNAs 的靶基因KEGG 和GO分析

我們應(yīng)用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)的miRNAs 的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，靶基因富集分值最高的十條信號(hào)通路見圖3A 所示，其中富集于PI3K-Akt 信號(hào)通路的靶基因共有46 個(gè)（圖3A）。富集于PI3KAkt 信號(hào)通路的46 個(gè)靶基因及其對(duì)應(yīng)的miRNAs詳 見表2，其中hsa-miR-19a-3p 調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)的靶基因包括PTEN、ITGB8、PIK3CB、PPP2R5E、SGK1、THBS1、TSC1、CCND2（表2）。PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路是調(diào)控自噬的重要通路。我們進(jìn)一步應(yīng)用GO（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)的miRNAs 的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，靶基因富集分值高的包括自噬等十條通路（圖3B）。KEGG與GO 分析均提示靶基因與自噬密切相關(guān)，因此我們進(jìn)一步研究了小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體通過miRNAs對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞自噬的影響。

2.4 SNCA-HM Exo 激活PI3K/Akt/mTOR 信 號(hào)通路，抑制SH-SY5Y細(xì)胞自噬

為研究被過表達(dá)α-synuclein的SH-SY5Y細(xì)胞外泌體激活的HM分泌的外泌體（SNCA-HM Exo）是否能通過miR-19a-3p 調(diào)控PTEN，進(jìn)而激活PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，最終抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬，我們將miR-19a mimic 以及miR-19a inhibitor 分別轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞，觀察它們對(duì)PTEN 以及PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Con-HM Exo+miR-19a mimic 組與SNCA-HM Exo 組PTEN（F=47.429，P＜0.001）、LC3Ⅱ/Ⅰ（F=64.295，P＜0.001）表達(dá)量與Con-HM Exo 對(duì)照組相比均出現(xiàn)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01；圖4），而SNCA-HM Exo 同時(shí)加用miR-19a inhibitor 后PTEN（F=47.429，P＜0.001）、LC3Ⅱ/Ⅰ（F=64.295，P＜0.001）表達(dá)量與單純SNCAHM Exo 組相比較，蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01；圖4）；Con-HM Exo+miR-19a mimic 組 與SNCA-HM Exo 組p-Akt/Akt（F=57.852，P＜0.001）、p-mTOR/mTOR（F=40.435，P＜0.001）、P62（F=42.105，P＜0.001）表達(dá)量與Con-HM Exo對(duì)照組相比，均出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01；圖4），而SNCA-HM Exo 同時(shí)加用miR-19a inhibitor 后p-Akt/Akt（F=57.852，P＜0.001）、p-mTOR/mTOR（F=40.435，P＜0.001）、P62（F=42.105，P＜0.001）蛋白表達(dá)與單純SNCA-HM Exo 相比較，均出現(xiàn)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01；圖4）。

圖2 PCR驗(yàn)證小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體中差異表達(dá)的miRNAsFig.2 Identification of differentially expressed miRNAs in microglia exosomes by PCR

表1 兩組小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體中差異表達(dá)的miRNAsTable 1 Differentially expressed miRNAs between GFP-con HM Exo and GFP-SNCA HM Exo

3 討論

帕金森病是一種神經(jīng)退行性疾病，它的的主要病理特點(diǎn)為L(zhǎng)ewy 小體在多巴胺能神經(jīng)元中的的形成和沉積以及這些多巴胺能神經(jīng)元的變性和死亡。Lewy 小體的主要由α-synuclein 蛋白組成。α-synuclein蛋白還可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞，引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［2］。異?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞可導(dǎo)致神經(jīng)元自噬功能障礙，這是其導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的機(jī)制之一。自噬障礙都可導(dǎo)致異常細(xì)胞器的降解出現(xiàn)障礙，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞變性死亡。研究發(fā)現(xiàn)，在帕金森疾病過程中增強(qiáng)自噬可以起到保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用，這與自噬促進(jìn)異常蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子的降解有關(guān)［3］。研究還發(fā)現(xiàn)［4］，自噬障礙可通過激活PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，激活炎癥反應(yīng)，加重帕金森病的進(jìn)展和惡化。目前很多研究均表明，自噬障礙是帕金森病病理生理機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)［5-6］，調(diào)控自噬有可能成為治療帕金森病的新的重要手段之一［7］。

外泌體是一種細(xì)胞分泌的微小囊泡，其可通過在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、mRNA 和miRNAs 等物質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能。很多細(xì)胞，包括神經(jīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞等均可分泌外泌體，外泌體可攜帶α-synuclein 蛋白在神經(jīng)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞之間傳遞［8-9］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)［1］，過表達(dá)α-synuclein 的SH-SY5Y 細(xì)胞外泌體通過miRNA-19a-3p 調(diào)控PTEN 通路，進(jìn)而抑制受體小膠質(zhì)細(xì)胞自噬，從而上調(diào)α-synuclein對(duì)MAPK 通路的激活效應(yīng)，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活。本文重點(diǎn)研究了小膠質(zhì)細(xì)胞被過表達(dá)αsynuclein 的SH-SY5Y 細(xì)胞外泌體異常活化后對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響及其機(jī)制，同時(shí)研究了小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體在其中的介導(dǎo)作用。

MicroRNAs（miRNAs）是一類小分子的RNA，通過與靶基因的3'端非編碼區(qū)的堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制靶基因的翻譯表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)功能。miRNAs調(diào)控靶基因表達(dá)廣泛參與了帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程［10-11］，然而其調(diào)控機(jī)制并未明確。本文對(duì)被過表達(dá)α-synuclein 的SH-SY5Y細(xì)胞外泌體異常激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體中的miRNAs 進(jìn)行芯片分析，研究了小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體中的miRNAs對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自噬功能的影響。

圖3 小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體中差異表達(dá)的miRNAs的靶基因KEGG分析Fig.3 KEGG and GO analysis of differentially expressed miRNAs in microglia exosomes.

我們通過miRNA 基因芯片技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，被過表達(dá)α-synuclein 的SH-SY5Y 細(xì)胞外泌體刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體（SNCA-HM Exo）與對(duì)照組外泌體之間存在表達(dá)差異的miRNAs，包括hsa-miR-19a-3p 等。通 過TargetscanHuman 7.1 及miRDBV5 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)對(duì)差異表達(dá)最顯著的miRNAs 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG 以及GO 分析，發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt 信號(hào)通路是靶基因富集分值最高的信號(hào)通路，富集于PI3K-Akt信號(hào)通路的靶基因共有46 個(gè)。PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路是自噬調(diào)控的重要通路之一［12］。mTOR 受到PI3K/AKt 信號(hào)通路的調(diào)控［13］。PI3K 被激活后可通過PIP3磷酸化AKT，使其活化，進(jìn)而磷酸化TSC-2，抑制TSC-1 和TSC-2 復(fù)合物的形成，減少其對(duì)Rheb 的抑制作用，最終磷酸化并激活mTOR，產(chǎn)生自噬抑制。雷帕霉素（Rapamycin）可通過抑制mTORC1 誘導(dǎo)自噬。我們進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)的miRNAs 的靶基因進(jìn)行GO 分析發(fā)現(xiàn)，靶基因富集分值高的包括自噬等十條通路。KEGG 與GO 分析均提示靶基因與自噬密切相關(guān)，因此我們進(jìn)一步研究了SNCA-HM Exo 通過miRNAs 對(duì)SH-SY5Y 自噬的影響。

表2 小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體中差異表達(dá)的miRNAs及其相應(yīng)的富集于PI3K-Akt信號(hào)通路的靶基因Table2 Differentially expressed miRNAs in microglia exosomes and their corresponding target genes enriching in PI3K Akt signaling pathway

圖4 Western blot 檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞PTEN及PI3K/Akt/mTOR自噬信號(hào)通路蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of PTEN/PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins detected

外泌體miRNAs 芯片分析發(fā)現(xiàn)，miR-19a-3p等15 個(gè)miRNAs 在SNCA-HM Exo 中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p 可負(fù)向調(diào)控自噬［13］。miR-19a-3p可靶向NBR2，調(diào)控AMPK/PPARα 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞的自噬［14］，同時(shí)可通過自噬抑制緩解缺血缺氧引發(fā)的心肌細(xì)胞損傷，或者通過靶向TGFβRII，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞的自噬功能，由此減輕TGF-β1 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞纖維化［15］。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-19a-3p 可通過靶向PTEN，調(diào)控PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡、自噬等病理生理過程［16］。PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路受到上游因子PTEN 的調(diào)控［17］，PTEN 是PIP3 磷酸酶，通過去磷酸化PIP3，抑制Akt 的磷酸化，促進(jìn)自噬。研究發(fā)現(xiàn)，目前有很多細(xì)胞因子可通過PTEN 調(diào)控自噬，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能［18］。PTEN是很多miRNAs 的靶基因，也是眾多miRNAs 在基因?qū)用嫔习l(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要調(diào)控靶點(diǎn)之一［19-20］。我們通過Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-19a-3p 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-19a-3p 與靶基因PTEN 3’-UTR區(qū)域共有3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而且此3個(gè)位點(diǎn)在不同種屬中高度保守。故我們重點(diǎn)研究了SNCAHM Exo 能否通過miR-19a-3p 調(diào)控受體神經(jīng)細(xì)胞PTEN/PI3K/Akt/mTOR 自噬信號(hào)通路，進(jìn)而抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬。

我們通過Western blot 檢測(cè)各組SH-SY5Y 細(xì)胞的PTEN及PI3K/Akt/mTOR 自噬信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，Con-HM Exo+miR-19a mimic組與SNCA-HM Exo 組PTEN、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)量與Con-HM Exo 對(duì)照組相比均出現(xiàn)下調(diào)，而SNCAHM Exo 同時(shí)加用miR-19a inhibitor 后PTEN、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)量與單純SNCA-HM Exo 組相比較，蛋白表達(dá)明顯增加；Con-HM Exo+miR-19a mimic 組與SNCA-HM Exo 組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、P62 表達(dá)量與Con-HM Exo 對(duì)照組相比，均出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，而SNCA-HM Exo 同時(shí)加用miR-19a inhibitor 后p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、P62 蛋 白表達(dá)與單純SNCA-HM Exo 相比較，均出現(xiàn)明顯降低，這說明miR-19a-3p 模擬物和SNCA-HM Exo 均可下調(diào)受體神經(jīng)細(xì)胞PTEN 的表達(dá)，由此激活PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，最終抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬。miR-19a-3p 抑制劑可阻斷SNCA-HM Exo對(duì)PTEN、PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路蛋白表達(dá)以及自噬的影響，說明SNCA-HM Exo 可通過miR-19a-3p 靶向調(diào)控PTEN，進(jìn)而調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)，最終抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬功能。

綜述所述，被過表達(dá)α-synuclein 的SH-SY5Y細(xì)胞外泌體激活的小膠質(zhì)細(xì)胞重新分泌的外泌體可通過miR-19a-3p 靶向抑制PTEN，從而激活PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，最終抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬。