巫孟師,熊敏敏,彭 丹,韓 雪,鐘小敏
(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程研究中心,廣東廣州 510080)
DANCR(differentiation antagonizing non-protein coding RNA)是一個(gè)最初在人表皮祖細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)具有維持細(xì)胞未分化狀態(tài)功能的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)分子[1]。近年來的研究顯示,DANCR 在多種腫瘤中存在異常高表達(dá)的現(xiàn)象,提示其在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[2-7]。雖然DANCR 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要功能逐漸被揭示,但是對于DANCR 作為癌基因(oncogene)的作用機(jī)制尚未完全探討清楚。研究結(jié)果表明,lncRNA 發(fā)揮功能的主要方式之一是直接結(jié)合具有調(diào)控功能的蛋白質(zhì)或核酸分子[8-11]。為了闡明DANCR 在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)理,本研究致力于構(gòu)建一種基于MS2 RNA 結(jié)合蛋白的特性,用于鑒定與DANCR 相互作用的生物活性分子的新方法。MS2 RNA 結(jié)合蛋白實(shí)質(zhì)為RNA型噬菌體MS2 外表面的衣殼蛋白,通過特異性結(jié)合噬菌體復(fù)制酶編碼基因5’端由19 個(gè)核苷酸組成的RNA 莖環(huán)結(jié)構(gòu),即MS2 結(jié)合位點(diǎn)(MS2 Bind?ing Site,MS2 BS),起著保護(hù)噬菌體核酸以及抑制翻譯的作用[12]。本研究計(jì)劃構(gòu)建表達(dá)Flag-MS2-EGFP 融合蛋白以及串聯(lián)表達(dá)DANCR-MS2 BS 的兩種載體,使用Flag 抗體對MS2 RNA 結(jié)合蛋白進(jìn)行免疫沉淀,同時(shí)對DANCR-MS2 BS 進(jìn)行富集,并進(jìn)一步使用已被證明為DANCR 相互作用分子的EZH2 蛋白作為陽性對照[11],驗(yàn)證MS2-RIP 方法的效果。成功構(gòu)建MS2-RIP 方法,對于探討DANCR 的工作機(jī)理具有重要的推動(dòng)作用,也可以為鑒定其他lncRNA 的相互作用分子提供技術(shù)基礎(chǔ)。
人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)及大腸桿菌菌株DH5α(購于天根生化科技有限公司)。pPyCAGIP(由Prof.Austin Smith from University of Cambridge 贈(zèng)予),pSL-MS2-12X 和pMS2-GFP質(zhì)粒(購于Addgene公司)。
DNA 純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(購于天根生化科技有限公司);限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、SacⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ(購于New England BioLabs 公司);Infusion kit(購自Takara 公司);Mil?lipore RIP 試劑盒(購自Millipore 公司);RNA 提取試劑TRI-Reagent(購自MRC公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司);TGXStain-Free丙烯酰胺免染制膠試劑盒(購自Bio-Rad 公司);熒光定量PCR 試劑(購于Roche 公司);EZH2 抗體試劑(購自Cell Signaling Technology 公司);ViaFect轉(zhuǎn)染試劑(購于Promega 公司);ANTI-FLAG M2 Magnetic Beads 試劑盒(購自Sigma 公司);RNA pulldown 試劑盒(購自ThermoFisher 公司);IP Lysis buffer(購自ThermoFisher 公司)。本文所用引物及探針由生工生物工程有限公司合成,引物序列見表1,探針序列見表2。
HCT116 細(xì)胞使用DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco,美國),添加100 mL/L胎牛血清(PAN,德國)及雙抗(100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素;Hyclone,美國),置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。
以pMS2-GFP 質(zhì)粒為模板,用MS2-GFP-F 和MS2-GFP-R 引物擴(kuò)增MS2-GFP 開放閱讀框。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收電泳產(chǎn)物。然后用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和SacⅠ酶切載體Flag/pPyCAGIP,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收電泳產(chǎn)物。將回收的MS2-GFP 片段和線性載體用Infusion 酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中,使用氨芐抗性的LB 平板篩選陽性克隆。挑取單克隆搖菌擴(kuò)增,提質(zhì)粒,送生工生物測序。測序正確的菌液轉(zhuǎn)移至30 mL含氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基中搖菌過夜,取0.5 mL 菌液與0.5 mL 已滅菌的30%甘油混合保存于-80 ℃,剩余菌液使用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。
以pSL-MS2-12X質(zhì)粒為模板,用MS2(12X)-F和MS2(12X)-DANCR-R 引物擴(kuò)增MS2 BS(12X)片段。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收電泳產(chǎn)物。以HCT116 細(xì)胞提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,用MS2(12X)-DANCR-F 和DANCR-R1 引物擴(kuò)增DANCR 片段,擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收電泳產(chǎn)物。然后用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切載體pPyCAGIP,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收電泳產(chǎn)物。將回收的MS2 BS(12X)片段、DANCR 片段和線性載體用Infusion 酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中,使用氨芐抗性的LB 平板篩選陽性克隆。挑取單克隆搖菌擴(kuò)增,提質(zhì)粒,送生工生物測序。測序正確的菌液轉(zhuǎn)移至30 mL 含氨芐抗性的液體LB 培養(yǎng)基中搖菌過夜,取0.5 mL 菌液與0.5 mL 已滅菌的30%甘油混合保存于-80 ℃,剩余菌液使用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。
表1 載體構(gòu)建引物Table 1 Primers for constructing vectors
表2 RNA pulldown的探針序列Table 2 Probe sequences for RNA pulldown
接種50%密度的HCT116 細(xì)胞于100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿,于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑(μL)與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(μg)的比例是3∶1,用1 mL Opti-MEM稀釋質(zhì)粒。質(zhì)粒用量和組合分別為12 μg Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP和8 μg DANCR-MS2 BS(12×)/pPyCAGIP、12 μg Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP 和8 μg DANCR/pPyC?AGIP、12 μg pPyCAGIP 和8 μg DANCR-MS2 BS(12×)/pPyCAGIP。室溫放置5 min,分別加入60 μL ViaFect 轉(zhuǎn)染試劑,輕輕混勻室溫放置15 min。將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的完全培養(yǎng)基換成無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,然后將混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中。24 h后更換為新鮮完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染48 h后用2.5 g/L胰酶消化后,用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀確定細(xì)胞數(shù)量。取1×107個(gè)細(xì)胞至1.5 mL干凈EP管中,用預(yù)冷的PBS洗兩遍后加入50 μL lysis buffer裂解細(xì)胞,放置于-80 ℃過夜。將細(xì)胞裂解液從-80 ℃取出于冰上解凍,每個(gè)樣品各取出5 μL input(RNA)和5 μL input(蛋白),然后分別加入430 μL wash buffer,17.5 μL 0.5 mol/L EDTA,2.5 μL RNase Inhibitor,吹打混勻,于4 ℃10 000 ×g離心10 min。取30 μL ANTI-FLAG M2 Magnetic Beads 懸液,用RIP kit 里的wash buffer洗兩遍。取離心后的上清于準(zhǔn)備好的磁珠中,4 ℃孵育過夜。用wash buffer 洗磁珠5 次,然后將磁珠分成兩份,分別用于RNA和蛋白質(zhì)提取。
使用Primer3 網(wǎng)站設(shè)計(jì)探針序列,并由生工生物合成5’端帶生物素標(biāo)記的探針。取1 pmol 探針和50 μL Pierce Nucleic-Acid Compatible Streptavi?din Magnetic Beads 常 溫結(jié)合30 min。取1×107個(gè)HCT116 細(xì)胞至1.5 mL 干凈EP 管中,加入120 μL IP Lysis Buffer 裂解細(xì)胞,冰上放置5 min 后,加入20 μL Protein-RNA Binding Buffer(10×)、60 μL 50%甘油,吹打混勻,于4 ℃10 000×g離心10 min。分別取20μL 上清作為RNA input 和總蛋白input,將剩下的上清加入結(jié)合探針的磁珠中,4 ℃孵育過夜。用1×wash buffer 洗磁珠2次,然后將磁珠分成兩份,分別用于RNA和蛋白質(zhì)提取。
加入500 μL Trizol 到用于RNA 提取的磁珠中,顛倒混勻,室溫放置15 min,加入200 μL DEPC水,顛倒混勻后室溫放置15 min,4 ℃,12 000×g離心15 min,取600 μL 上清至新的1.5 mL 離心管中,加入等體積的異丙醇和5 μg 糖原后充分混勻,室溫放置10 min,4 ℃,10 000×g離心15 min,管底可見白色沉淀。棄上清,每管加入400 μL 750 mL/L乙醇漂洗,4 min,5 000 ×g,棄上清后,重復(fù)一遍漂洗過程,晾干RNA 沉淀至邊緣透明時(shí)加入適量DEPC 水溶解,提取的RNA 全部按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,q-DANCR-F:GCCACTATGTAGCGGGTTTC;
q-DANCR-R:GCCTGTAGTTGTCAACCTGC;q-U1-F:TTTCCCAGGGCGAGGCTTAT;q-U1-R:TGCAG?TCGAGTTTCCCACATT,熒光定量PCR 每孔體系為:cDNA 1 μL、SYBR 5 μL、引物2 μL、水2 μL,總體系10 μL,熒光定量PCR儀檢測,數(shù)據(jù)分析。
加入適量的1× loading buffer 到用于蛋白提取的磁珠中,95 ℃處理10 min,于磁力架上取含蛋白的上清至新的EP 管中備用。Western blot 10%預(yù)混膠配制,①分離膠:3 mL Resolver A,3 mL Re?solver B,30 μL 10% APS(Ammonium persulfate,過硫酸銨),3 μL TEMED。②濃縮膠:1 mL Stacker A,1 mL Stacker B,10 μL 10% APS(Ammonium persulfate,過硫酸銨),2 μL TEMED。取準(zhǔn)備好的樣品進(jìn)行垂直電泳,200 V,30 min。電泳結(jié)束后,將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜到0.45 μm 聚偏二氟乙烯(PVDF)上,200 mA 60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,取出PVDF 膜,5%脫脂牛奶封閉1 h。用5% BSA 配制EZH2 一抗,4 ℃孵育過夜。取出室溫?fù)u床上再繼續(xù)孵育30 min后,用TBS/T洗3次,5 min/次;加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h。用TBS/T 洗3次,5 min/次,加入化學(xué)發(fā)光底物ECL,使用Bio-Rad成像系統(tǒng)檢測條帶。
統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 26.0 完成。兩組計(jì)量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組計(jì)量資料的比較進(jìn)行單因素方差分析,方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)多重比較采用LSD、Dunnett'st檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
本研究構(gòu)建了兩個(gè)重組載體Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP 和DANCR-MS2 BS(12×)/pPyCAGIP,用于下游MS2-RIP 實(shí)驗(yàn)。Flag-MS2-EGFP/pPyCA?GIP 載體用于外源過量表達(dá)帶有Flag 標(biāo)簽和GFP熒光蛋白的MS2 RNA 結(jié)合蛋白。Flag 標(biāo)簽由于其氨基酸序列較短,一般不會(huì)干擾融合蛋白(本研究中為MS2 蛋白)的天然構(gòu)象。另外,耦聯(lián)高特異性Flag 抗體的磁珠,較容易從商品化渠道購買獲得,可保證不同批次的RIP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。因此,我們在構(gòu)建重組載體時(shí),引入Flag標(biāo)簽至MS2蛋白的N 端,用于高效捕獲MS2 蛋白。另外,MS2 蛋白的C端還帶有融合表達(dá)的EGFP蛋白,便于直接觀察融合蛋白Flag-MS2-EGFP 的表達(dá)效率。DANCRMS2 BS(12×)/pPyCAGIP 載體用于過量表達(dá)5’端帶有MS2 BS(12個(gè)拷貝)的重組型DANCR 轉(zhuǎn)錄本。帶有MS2 BS 的DANCR,可有效地被MS2 蛋白識別及捕獲,并且不受DANCR 本身序列性質(zhì)的影響。該策略的另一個(gè)優(yōu)勢是,MS2蛋白的作用位點(diǎn)獨(dú)立于DANCR轉(zhuǎn)錄本,因此不會(huì)干擾其他與DANCR相互作用的分子的結(jié)合。另外,我們還構(gòu)建了不帶有MS2 BS 的DANCR 重組載體DANCR/pPyCAGIP 作為對照,用于評估系統(tǒng)性的非特異結(jié)合背景。以上質(zhì)粒的構(gòu)造見示意圖1。
將下列三組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞:(Test group)Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP 和DANCR-MS2 BS(12×)/pPyCAGIP;(Control group 1)Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP和DANCR/pPyCAGIP;(Controlgroup 2)pPyCAGIP 和DANCR-MS2 BS(12×)/pPyCAGIP。轉(zhuǎn)染后48h,檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度和DANCR 的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染后的HCT116 細(xì)胞熒光和明場合成圖如圖所示(圖2A),Test group 和Control group 1 的熒光強(qiáng)度相近,綠色熒光蛋白成功表達(dá)。隨后,提取HCT116 細(xì)胞的總RNA 檢測DANCR 的過表達(dá)水平。結(jié)果如圖2B 所示,Test group,Control group 1和Control group 2 中,DANCR 的表達(dá)水平分別為WT HCT116 細(xì)胞的(427.35±10.13)倍,(348.60±6.14)倍,以及(523.37±3.76)倍。(4組樣本量分別為3,做單因素方差分析F=4019.50,P<0.001;Dun?nett'st檢驗(yàn)中,Test group 與WT 相比較,P<0.001;Control group 1 與WT 相 比 較,P<0.001;Control group 2與WT相比較,P<0.001)
圖1 質(zhì)粒構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組示意圖Fig.1 Diagram of plasmid construction and plasmid combinations of groups
如上所述,將Test group,Control group 1和Con?trol group 2 三組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞。48 h后收集1×107細(xì)胞進(jìn)行MS2-RIP 實(shí)驗(yàn)(圖3)。從MS2-RIP 獲得的免疫沉淀復(fù)合物提取RNA,用于檢測DANCR的富集效果,并以U1作為參照。熒光定量PCR 結(jié)果如圖4A 所示,與Control group 1、2比較,Test group 中DANCR 有明顯的富集效果。Test group 富集的DANCR 占相應(yīng)input 的比例為(0.083 5±0.004 8)%,而兩個(gè)Control group 分別為(0.007 7±0.007 2)%及(0.004 3±0.003 4)%,Test group 與兩組Control group 的差異都具有統(tǒng)計(jì)意義(3 組樣本量分別為3,單因素方差分析結(jié)果顯示,F(xiàn)=203.665,3 組DANCR 的富集水平有差異;LSD 檢 驗(yàn) 結(jié)果 表 明,Test group 與Control group 1相 比 較,P<0.001;Test group 與Control group 2 相比較,P<0.001;Control group 1 與Control group 2 相比較,P=0.475;圖4A,左)。然而,Test group 對非編碼RNA U1 的富集量為(0.081 9±0.021 8)%,與兩個(gè)Control group 的富集量(0.087 5±0.010 6)%和(0.060 0±0.002 9)%相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)意義(3 組樣本量分別為3,單因素方差分析結(jié)果顯示,F(xiàn)=3.17,P=0.115;圖4A,中)。同時(shí),我們用Western blot 方法檢測了免疫沉淀復(fù)合物中與DANCR 相結(jié)合的蛋白質(zhì),即陽性對照EZH2蛋白。如圖4A結(jié)果顯示,Test group 的免疫沉淀樣品可顯著檢測到EZH2 蛋白,而Control group 1 和Control group 2 中EZH2信號均為陰性(圖4A,右)。
圖2 重組質(zhì)粒表達(dá)效率檢測Fig.2 Expression efficiency of recombinant vectors
圖3 MS2-RIP流程示意圖Fig.3 A schematic diagram of the MS2-RIP strategy
為了更好地驗(yàn)證MS2-RIP 方法的有效性,我們還與廣泛使用的RNA pulldown 方法進(jìn)行了比較。RNA pulldown 方法,通過設(shè)計(jì)兩種不同的可與DANCR 的序列進(jìn)行堿基反向互補(bǔ)的DNA 探針(DANCR1 和DANCR2),達(dá)到對DANCR 及其相互作用分子的捕獲。如圖4B 所示,兩種探針均對DANCR 有一定的富集效果,DANCR1 為(0.040 6 ±0.009 6)%,DANCR2 為(0.050 1 ± 0.017 8)%,相應(yīng)的對照ctrl1 和ctrl2 分別為(0.007 0±0.003 4)%及(0.007 6±0.003 8)%。DANCR1 與ctrl1、DANCR 與ctrl2的差異都具有統(tǒng)計(jì)意義(ctrl1和DANCR1的樣本量均為6,獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,t=8.033,P<0.05,顯示兩組DANCR 的富集水平有差異;ctrl2和DANCR2 的樣本量均為3,獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,t=-4.022,P<0.05,顯示兩組DANCR 的富集水平有差異;圖4B,左)。DANCR1、DANCR2對非編碼RNA U1 的富集量為分別為(0.041 3±0.014 6)%和(0.186±0.0671)%,與ctrl1、ctrl2的富集量(0.062 8±0.018 6)%和(0.305±0.094)%分別相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)意義(ctrl1 和DANCR1 的樣本量均為6,ctrl1和DANCR1 的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,t=-2.22,P=0.51;ctrl2 和DANCR2 的 樣本 量 均 為3,ctrl2和DANCR2 的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,t=1.78,P=0.15)(圖4B,中)。同時(shí),Western blot 結(jié)果顯示,DANCR1 和DANCR2 的免疫沉淀樣品均能檢測到EZH2 蛋白,而ctrl1 及ctrl2 中EZH2 信號均為陰性(圖4B,右)。
對MS2-RIP和RNA pulldown方法的結(jié)果進(jìn)行比較,如圖4C 所示,RNA pulldown 方法的陽性探針組(DANCR1和DANCR2)對DANCR的富集效率(分別為(0.040 6±0.009 6)%和(0.050 1±0.017 8)%),低于MS2-RIP 方法的Test group(0.083 5±0.004 8)%(DANCR1 組樣本量為6,DANCR2 和Test group 組樣本量分別為3,單因素方差分析結(jié)果顯示,F(xiàn)=14.492,P<0.05,3 組DANCR 的富集水平有差異;Dunnett'st檢驗(yàn)結(jié)果表明,Test group 與DANCR1相比較,P<0.05;Test group 與DANCR2 相比較,P<0.05)。另外,對上述兩種方法捕獲的EZH2蛋白的Western Blot條帶進(jìn)行光密度定量分析(圖4C,右),結(jié)果顯示MS2-RIP 方法對EZH2 蛋白的富集效果優(yōu)于RNA pulldown 方法。MS2-RIP 的Test group 富集的EZH2 蛋白占其input 的比例為(8.09±3.29)%,而DANCR1 和DANCR2 富集的EZH2 蛋白占相應(yīng)input 的比例分別為(1.5±1.1)%及(2.28±0.99)%。Test group 與DANCR1、Test group 與DANCR2 的 差異都具有統(tǒng)計(jì)意義(3 組樣本量分別為3,單因素方差分析結(jié)果顯示,F(xiàn)=10.204,P<0.05,3 組EZH2的富集水平有差異;Dunnett'st檢驗(yàn)結(jié)果表明,Test group 與DANCR1 相比較,P<0.05;Test group 與DANCR2相比較,P<0.05)。
以上結(jié)果說明,MS2-RIP方法可以高度特異性地富集目標(biāo)RNA DANCR,而對非特異性RNA U1分子沒有顯著的富集作用,因此可用于下游進(jìn)一步檢測共同被捕獲的DANCR 相互作用分子。同時(shí),對比廣泛使用的RNA pulldown 方法,MS2-RIP 方法富集DANCR 和捕獲EZH2 蛋白的效率明顯更高,說明MS2-RIP 方法將來可用于有效鑒定更多未知的DANCR相互作用分子。
圖4 MS2-RIP 方法的富集效率Fig.4 The enrichment efficiency of MS2-RIP strategy
長鏈非編碼RNA 作為一類長度大于200 個(gè)核苷酸、通常不具有蛋白質(zhì)編碼能力的內(nèi)源性RNA,能夠在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié),從而廣泛地參與包括細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育在內(nèi)的重要生命過程,其異常表達(dá)還與多種人類重大疾?。ㄈ缒[瘤)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來關(guān)于lncRNA 的研究進(jìn)展迅猛,但是絕大部分lncRNA 的作用機(jī)制仍不清楚。LncRNA DANCR基因是一個(gè)位于人類染色體4 號,長度為915 bp 的長鏈非編碼RNA,最初在人表皮祖細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)具有維持細(xì)胞未分化狀態(tài)的功能[1]。廣泛的研究數(shù)據(jù)表明,DANCR 可以作為腫瘤的標(biāo)志物,其在多種腫瘤中的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、浸潤以及腫瘤血管新生等有密切關(guān)聯(lián)[13-16],可作為靶向性治療腫瘤的新靶標(biāo)。然而,目前對于lncRNA DANCR 功能和機(jī)制的研究尚未完善。
以往的研究報(bào)道,lncRNA 行使功能的機(jī)制大部分體現(xiàn)在從不同的水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,包括染色質(zhì)的表觀遺傳修飾水平,轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平,mRNA 穩(wěn)定性水平,以及翻譯調(diào)控水平。而且,lncRNA常以與蛋白質(zhì)、RNA或DNA相結(jié)合的方式,參與調(diào)控基因表達(dá)。例如,在間充質(zhì)干細(xì)胞中,DANCR可與表觀遺傳修飾因子EZH2蛋白結(jié)合,影響RUNX2 基因表達(dá),抑制成骨分化[11]。lncRNA HOTAIR 既可結(jié)合蛋白質(zhì)又可結(jié)合DNA,通過招募沉默復(fù)合物PRC2 和LSD1/CoREST/REST 復(fù)合物至特定DNA 區(qū)域,使組蛋白H3K27 和H3K4 分別進(jìn)行甲基化和去甲基化修飾,從而使其調(diào)控的一系列基因表達(dá)下調(diào)[10]。另外,一些lncRNA 的序列中含有microRNA 的結(jié)合位點(diǎn),可以行使海綿(sponge)作用對調(diào)節(jié)性microRNA 進(jìn)行吸附,從而使被microRNA 調(diào)控的mRNA 分子得到釋放,表達(dá)增加[8-9]。因此,鑒定與lncRNA 相互作用的生物活性分子,有助于準(zhǔn)確闡明lncRNA 的作用機(jī)制。
為了探討DANCR 在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)理,本研究致力于構(gòu)建一種用于鑒定與DANCR相互作用的生物活性分子的新方法。常見的鑒定lncRNA相互作用分子的方法包括RNA pulldown 和RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA-binding protein immunopre?cipitation,RIP)。RNA pulldown 方法通過使用人工合成的序列互補(bǔ)性探針富集lncRNA,間接捕獲結(jié)合lncRNA 的生物活性分子。該方法受限于探針與靶標(biāo)的親和力,探針序列的特異性,以及探針與靶標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)可能覆蓋相互作用分子的結(jié)合序列等因素,因此其捕獲效率因不同lncRNA 分子而異。RIP 方法則使用lncRNA 的候選結(jié)合蛋白的特異性抗體,通過免疫共沉淀富集lncRNA-蛋白復(fù)合物,進(jìn)一步檢測lncRNA 在免疫沉淀復(fù)合物中的含量判斷二者結(jié)合的可能性或效率。然而,該方法要求lncRNA 結(jié)合蛋白已知,并且可獲得高特異性的抗體。因此,一般的RIP方法不適用于探討未知的lncRNA 結(jié)合蛋白,以及與lncRNA 結(jié)合的RNA/DNA 分子。為了解決上述問題,本研究構(gòu)建了一種基于MS2 RNA 結(jié)合蛋白特性,以DANCR 為誘餌捕獲相互作用分子的新方法。我們設(shè)計(jì)使DANCR 與多個(gè)拷貝的MS2 BS 形成串聯(lián)轉(zhuǎn)錄本,通過將帶有Flag 標(biāo)簽的MS2 RNA 結(jié)合蛋白進(jìn)行免疫沉淀,即可高效捕獲DANCR 及其相互作用分子。該方法的優(yōu)勢在于以下幾方面:①M(fèi)S2 RNA 結(jié)合蛋白與MS2 BS 的結(jié)合力強(qiáng),通過人為增加MS2 BS 拷貝數(shù),可使DANCR 的富集效率達(dá)到最優(yōu)化;②富集DANCR的關(guān)鍵作用位點(diǎn)為MS2 BS,該位點(diǎn)不屬于DAN?CR 轉(zhuǎn)錄本中的天然序列,可避免干擾DANCR 與其相互作用分子的結(jié)合;③商品化的Flag 抗體具有高度親和性和特異性,可使MS2 RNA 結(jié)合蛋白的免疫沉淀效率得到保證;④單獨(dú)使用MS2-RIP方法,即可同時(shí)檢測與DANCR 相互作用的蛋白質(zhì)或RNA 分子,節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本。
本文的研究結(jié)果初步表明,與RNA pulldown方法相比較,MS2-RIP方法由于利用了MS2蛋白與其特異性結(jié)合位點(diǎn)的親和力作為基礎(chǔ),得以高效地富集DANCR;同時(shí),MS2-RIP 實(shí)驗(yàn)要求外源性過量表達(dá)DANCR(形成DANCR-MS2 BS(12X)重組轉(zhuǎn)錄本),因此可增加被富集的DANCR 轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù),從而提高捕獲DANCR 結(jié)合蛋白EZH2的效果(圖4)。而且,與RNA pulldown 方法中探針結(jié)合序列可能覆蓋未知相互作用分子的結(jié)合位點(diǎn)的情況不同,MS2-RIP 方法對DANCR 的富集不依賴于DANCR 本身序列,可避免與潛在的相互作用分子發(fā)生競爭性結(jié)合,因此可提高捕獲DANCR 相互作用分子的效率。所以從理論上來說,MS2-RIP 方法可針對任意一種lncRNA 展開相互作用分子的鑒定及其作用機(jī)制探討,具有廣泛的適用性。
綜上所述,MS2-RIP方法可以達(dá)到特異性高效富集目的lncRNA DANCR 及其相互作用分子的目的。該方法為探討lncRNA DANCR 的作用機(jī)制,以及鑒定其他lncRNA 的相互作用分子提供了一種新的策略。