不同種類微生物對(duì)碳酸鹽巖溶蝕普遍性

齊義彬， 丁 茜， 朱東亞， 何治亮

(1.中國石油化工股份有限公司石油勘探開發(fā)研究院， 北京 100083； 2.中國石油化工股份有限公司， 北京 100728)

碳酸鹽巖在地殼中分布十分廣泛，約占沉積巖總面積的20%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上超過60%的油氣產(chǎn)量都是來自碳酸鹽巖儲(chǔ)層[1]。中國的海相碳酸鹽巖地層分布面積達(dá)300×105km2，具有良好的油氣勘探潛力[2]。而現(xiàn)階段油氣勘探實(shí)踐已經(jīng)表明，優(yōu)質(zhì)碳酸鹽巖儲(chǔ)層的形成是發(fā)育在有利沉積相帶的基礎(chǔ)上，受表生溶蝕、埋藏溶蝕和構(gòu)造運(yùn)動(dòng)等多種因素共同作用的結(jié)果[3]。

隨著研究的深入和發(fā)展，表生溶蝕中的生物巖溶在巖溶發(fā)育過程中的作用逐漸得到了重視。生物巖溶指的是生物參與的喀斯特作用，加速溶蝕或沉積過程與現(xiàn)象的總稱[4]。這一現(xiàn)象在巖溶區(qū)普遍發(fā)生，因生物活動(dòng)生成大量二氧化碳，源源不斷地進(jìn)入溶蝕作用系統(tǒng)，打破化學(xué)平衡，使溶蝕繼續(xù)，此外，生物活動(dòng)還可以生成有機(jī)酸，增加溶蝕。國內(nèi)外研究者對(duì)生物巖溶的研究多集中在高等植物、地衣、藻類等方面，聶磊等[5]研究了表面藍(lán)藻對(duì)石灰?guī)r的巖溶侵蝕能力，王奇崗等[6]研究水生植物對(duì)碳酸鹽的巖溶作用。諸多研究揭示出地衣、藻類或高等植物覆蓋處的巖溶作用強(qiáng)烈，土壤持水性、土壤肥力、酶活性均好于裸露巖石。

而有關(guān)微生物的巖溶作用研究主要集中在沉積作用方面，寧卓等[7]研究了自養(yǎng)微生物代謝及誘導(dǎo)產(chǎn)生碳酸鹽巖沉淀作用，鐘福平等[8]研究了微生物和生物膜的鈣化引起碳酸鹽巖的沉淀作用。總體上，目前關(guān)于微生物對(duì)礦物的溶蝕研究雖然較多，但對(duì)碳酸鹽巖的溶蝕作用的研究較少，僅有少部分細(xì)菌對(duì)碳酸鹽溶蝕作用的研究[9]。而對(duì)于真菌和放線菌的溶蝕動(dòng)態(tài)研究尚未見報(bào)道，而比較不同類群微生物(細(xì)菌、真菌和放線菌)的溶蝕作用效果將有助于評(píng)價(jià)不同種類微生物在生物巖溶中的作用和地位，為探索它們的溶蝕作用機(jī)理提供依據(jù)。

因此，研究注重從自然環(huán)境中篩選到3種不同類型的最具代表性的微生物(細(xì)菌、放線菌和真菌)，通過對(duì)其培養(yǎng)研究不同類型微生物對(duì)碳酸鹽巖溶蝕作用的普遍性，比較不同種類微生物溶蝕作用效果，并探討微生物在多孔介質(zhì)中的溶蝕作用，初步研究微生物溶蝕在表生巖溶中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 菌株

從自然環(huán)境的巖石表面中篩選到實(shí)驗(yàn)用的細(xì)菌、放線菌和真菌，分別編號(hào)為Q1、Q2和Q3，經(jīng)鑒定，細(xì)菌Q1屬于芽孢桿菌屬，放線菌Q2屬于鏈霉菌屬，真菌Q3屬于曲霉菌屬。從生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)可以得知，這三種微生物均能夠在較為惡劣的巖溶環(huán)境中生長(zhǎng)代謝[10-11]。

1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽+蔗糖培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 2，Na2HPO41，KH2PO41，NaNO33，NH4Cl 1，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，CaCl20.1。pH 7.2。

高氏1號(hào)培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉 20，KNO31，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01。pH 7.6。

以上培養(yǎng)基均溶于1 000 mL水中，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(g/L)：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加1 000 mL水煮沸 30 min，再加20 g葡萄糖，紗布過濾，115 ℃滅菌15 min。

1.3 菌株培養(yǎng)

芽孢桿菌屬Q(mào)1、鏈霉菌屬Q(mào)2和曲霉菌屬Q(mào)3的發(fā)酵時(shí)間均為48 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，3種菌均以120 r/min振蕩培養(yǎng)，接種量為5%[12]。

將芽孢桿菌屬Q(mào)1、鏈霉菌屬Q(mào)2和曲霉菌屬Q(mào)3在斜面上劃線培養(yǎng)(30 ℃)24 h后，用無菌水將菌體洗下，調(diào)整菌體濃度值1×106CFU/mL的發(fā)酵液作為種子液備用。

1.4 碳酸鹽巖樣品

實(shí)驗(yàn)所用方解巖和白云巖采自四川盆地野外剖面的純凈樣品，做成長(zhǎng)0.5 cm、寬0.5 cm、高 0.5 cm 的正方形樣品，經(jīng)雙蒸水洗滌后烘干，滅菌備用。

1.5 微生物產(chǎn)酸能力分析方法

測(cè)定芽孢桿菌Q1、鏈霉菌Q2和曲霉菌Q3的產(chǎn)酸能力，分別配制無機(jī)鹽+蔗糖、高氏1號(hào)和PDA培養(yǎng)基，調(diào)整pH 7。將120 mL培養(yǎng)基置于250 mL三角瓶中，然后按照5%的比例分別接種Q1、Q2和Q3種子液，以120 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，分別在不同時(shí)間檢測(cè)培養(yǎng)體系中pH變化。相同條件下不接種培養(yǎng)基為對(duì)照組[13]。

1.6 微生物對(duì)碳酸鹽巖溶蝕速率的分析方法

測(cè)定芽孢桿菌Q1、鏈霉菌Q2和曲霉菌Q3對(duì)方解巖和白云巖的溶蝕速率，分別配制無機(jī)鹽+蔗糖、高氏1號(hào)和PDA培養(yǎng)基，調(diào)整pH 7，將120 mL培養(yǎng)基置于250 mL三角瓶中，每瓶培養(yǎng)基中額外加入4塊方解巖或白云巖樣品，然后按照5%的比例分別接種Q1、Q2和Q3種子液，以120 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，分別在不同時(shí)間收集樣品測(cè)定Ca2+濃度，計(jì)算白云石/方解石溶蝕速率，相同條件下不接種培養(yǎng)基為對(duì)照組[14-15]。

1.7 多孔介質(zhì)條件下微生物對(duì)碳酸鹽巖溶蝕分析方法

利用微生物物理驅(qū)油模型研究不同微生物在多孔介質(zhì)條件下對(duì)白云巖的溶蝕情況，將白云石粉末(100目)裝入填砂管中制作填砂管模型，巖心驅(qū)替模擬實(shí)驗(yàn)裝置和巖心參數(shù)如圖1和表1所示。首先在巖心中注入菌株對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，直到巖心中充滿營(yíng)養(yǎng)，隨后分別向巖心中注入30%空隙體積(pore volume, PV)的微生物種子液，然后在30 ℃下培養(yǎng)28 d。最后測(cè)定巖心中Ca2+濃度和巖心滲透率的變化，對(duì)照組在相同的條件下用無機(jī)鹽培養(yǎng)基代替微生物懸浮液[16-17]。

表1 巖心參數(shù)表

圖1 巖心驅(qū)替模擬實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Core displacement experiment device

1.8 分析方法

分別用pH 4.0和pH 7.0的標(biāo)準(zhǔn)樣品校正雷磁

PHSJ-5型pH計(jì)，然后測(cè)定各培養(yǎng)體系的pH，每個(gè)樣品測(cè)3次，取平均值。采用離子色譜技術(shù)和電感耦合等離子體發(fā)射光譜技術(shù)分析各培養(yǎng)體系中Ca2+濃度[18-19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類微生物產(chǎn)酸的動(dòng)態(tài)變化

各試驗(yàn)組和對(duì)照組pH的變化如圖2所示，可以看出，各實(shí)驗(yàn)體系中pH的變化呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，對(duì)照組的pH呈現(xiàn)輕微降低的趨勢(shì)是因?yàn)樵谡袷幍倪^程中溶解了空氣中的二氧化碳，而實(shí)驗(yàn)組pH降低的特別明顯說明實(shí)驗(yàn)中所使用的各種類型的微生物在生長(zhǎng)代謝的過程產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，但是不同種類的微生物對(duì)體系pH的影響程度明顯不同[20]。培養(yǎng)后芽孢桿菌Q1的菌濃達(dá)到了8.96×108CFU/mL，培養(yǎng)體系的pH降低了1.64；鏈霉菌Q2的菌濃達(dá)到了6.89×109CFU/mL，培養(yǎng)體系的pH降低了2.23；曲霉菌Q3的菌濃達(dá)到了9.83×109CFU/mL，培養(yǎng)體系的pH降低了2.69。由此可見，真菌在生長(zhǎng)代謝過程中生長(zhǎng)速率最快，產(chǎn)生的酸性物質(zhì)也最多，其次是放線菌，細(xì)菌最后。以上結(jié)果說明，自然與巖溶環(huán)境中的微生物在其生長(zhǎng)代謝過程中能夠產(chǎn)生酸性物質(zhì)。這些酸性物質(zhì)一部分是微生物代謝產(chǎn)生的碳酸酐酶(CA)將代謝產(chǎn)生的二氧化碳轉(zhuǎn)化成碳酸[21]，另一部分是微生物在代謝循環(huán)過程中會(huì)形成有機(jī)酸(丙酮酸、延胡索酸等)[22]。

圖2 微生物培養(yǎng)過程中pH變化Fig.2 Change of pH in microbial system culture

2.2 不同種類微生物對(duì)碳酸鹽巖溶蝕的動(dòng)態(tài)變化

各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Ca2+濃度的動(dòng)態(tài)變化如圖3所示，可以看出，培養(yǎng)120 h后，芽孢桿菌Q1-方解巖和芽孢桿菌Q1-白云巖培養(yǎng)體系中Ca2+濃度分別達(dá)到了171 mg/L和133 mg/L；鏈霉菌Q2-方解巖和鏈霉菌Q2-白云巖培養(yǎng)體系中Ca2+濃度分別達(dá)到了198 mg/L和166 mg/L；曲霉菌Q3-方解巖和曲霉菌Q3-白云巖培養(yǎng)體系中Ca2+濃度分別達(dá)到了 327 mg/mL 和258 mg/L；這說明實(shí)驗(yàn)所用的典型細(xì)菌、真菌和放線菌均對(duì)方解巖和白云巖有明顯溶蝕作用，其中真菌的溶蝕效果最顯著，明顯高于鏈霉菌和細(xì)菌培養(yǎng)體系。而這些結(jié)果又與3種微生物產(chǎn)酸動(dòng)態(tài)情況相符[23]。

圖3 微生物-碳酸鹽巖培養(yǎng)體系中Ca2+濃度變化Fig.3 Changes of Ca2+ concentration in microbial-carbonatite culture system

對(duì)于不同類型碳酸鹽巖，微生物對(duì)其溶蝕速率也有所不同，微生物對(duì)方解石的溶蝕比對(duì)白云巖溶蝕釋放出更多的Ca2+，以上結(jié)果說明在相同的微生物培養(yǎng)條件下，方解巖的溶蝕速率明顯要快于白云巖[24]。

2.3 微生物巖心驅(qū)替溶蝕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

多孔介質(zhì)條件下微生物對(duì)碳酸鹽巖溶蝕情況結(jié)果如表2所示，可以看出，在選用的白云巖巖心的孔隙度和滲透率都接近的條件下，微生物在多孔介質(zhì)中培養(yǎng)后，滲透率均明顯增加了，而且溶液中Ca2+濃度明顯升高。具體來看，芽孢桿菌Q1的巖心滲透率增加了51.7×10-3μm2，鏈霉菌Q2的巖心滲透率增加了66.2×10-3μm2，曲霉菌的巖心滲透率增加了89.1×10-3μm2。同時(shí)各實(shí)驗(yàn)組中Ca2+濃度也明顯升高，分別達(dá)到了132.4、154.5、207.4 mg/L。以上結(jié)果說明，這3種微生物均能夠在多孔介質(zhì)中代謝酸性物質(zhì)溶蝕白云巖，真菌Q3溶蝕速率最快，放線菌Q2次之，細(xì)菌Q1溶蝕速率較慢；同時(shí)，微生物除了在巖石表面產(chǎn)生溶蝕作用，在合適的多孔介質(zhì)巖心中也能夠?qū)μ妓猁}巖等產(chǎn)生溶蝕作用。這表明，微生物巖溶很有可能發(fā)生在較大表層巖石范圍內(nèi)，微生物巖溶在表生巖溶中起重要作用[25]。

表2 白云巖巖心溶蝕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

(1)從巖石表面中篩選到最常見的芽孢桿菌Q1、鏈霉菌Q2和曲霉菌Q3，這3種微生物在生長(zhǎng)代謝過程中均能夠產(chǎn)生酸性物質(zhì)，降低培養(yǎng)體系的pH。

(2)這3種微生物均能夠溶蝕方解巖和白云巖，提高環(huán)境中Ca2+濃度，但不同種屬的微生物的溶蝕速率存在差別，曲霉菌Q3溶蝕速率最快，細(xì)菌Q1最慢；同時(shí)，這3種微生物對(duì)方解巖的溶蝕能力明顯強(qiáng)于白云巖。

(3)多孔介質(zhì)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，微生物除了對(duì)碳酸鹽巖表面產(chǎn)生溶蝕作用，在多孔介質(zhì)巖心中也能夠?qū)μ妓猁}巖等產(chǎn)生溶蝕作用。

(4)微生物對(duì)碳酸鹽巖溶蝕作用具有普遍性，微生物巖溶很有可能發(fā)生在較廣泛的表層巖石范圍內(nèi)，是碳酸鹽巖儲(chǔ)層形成的重要因素之一。