藻菌共生體系的建立及其對造紙廢水的處理效果

張 波, 陳佳琛, 崔夢瑤, 劉珂軼, 張安龍

(陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 西安 710021)

微藻是一類在自然界中分布廣泛的微生物，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，因其可高效吸收氮磷營養(yǎng)及較高的化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand,COD)去除率而被應(yīng)用于廢水處理。常見的用于廢水處理的微藻種類主要有綠藻門的小球藻(Chlorella)[1-3]、柵藻(Scenedesmus)[4-6]、衣藻(Chlamydomonas)[6-7]和藍(lán)藻門的螺旋藻(Spirulina)[8]、顫藻(Oscillatoria)[9]等。許多研究表明，微藻可用于各種廢水的處理，如工業(yè)廢水[4-5]、市政污水[10]、農(nóng)業(yè)廢水[1]等。利用廢水培養(yǎng)微藻可在廢水凈化的同時(shí)積累微藻生物量，用于生物柴油、生物飼料等領(lǐng)域，大幅降低微藻的培養(yǎng)成本，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)廢水的無害化處理與資源化利用。

制漿造紙工業(yè)是中國國民經(jīng)濟(jì)支柱性產(chǎn)業(yè)之一，給中國帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)收益，但造紙生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的造紙廢水給水生態(tài)環(huán)境帶來了巨大的壓力。造紙廢水具有排放量大、各段廢水成分復(fù)雜、處理難度大等特點(diǎn)。經(jīng)過一級物化、二級生化處理后仍不能達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。近年來，芬頓高級氧化技術(shù)多被應(yīng)用于造紙廢水三級深度處理，然而其反應(yīng)條件窄、藥劑成本高、二次污染嚴(yán)重等問題限制其更廣泛的應(yīng)用[11-12]。相比之下，藻菌共培養(yǎng)體系用于造紙廢水三級深度處理具有顯著優(yōu)勢，其處理成本低、效果好且獲得的微藻生物質(zhì)可進(jìn)一步加工制備高附加值產(chǎn)品，提高經(jīng)濟(jì)效益。利用藻菌共生體系處理廢水技術(shù)具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益，是深度處理造紙廢水的一種很有發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。

近年來，關(guān)于建立藻菌共生體系以提高微藻生物量、油脂產(chǎn)率和污水處理效率的研究已有一定的進(jìn)展。衛(wèi)治金等[13]在缺氮條件下將無菌小球藻與細(xì)菌以不同初始比例共培養(yǎng)，結(jié)果表明，在小球藻與固氮菌70∶1(V/V) 共培養(yǎng)體系中，其生物量和油脂含量分別較單獨(dú)小球藻培養(yǎng)時(shí)提高了66.3%和47.7%。Bashan等[14]采用小球藻和巴西固氮螺菌(Azospirillum) 組成的藻菌共生體系用于處理城市污水，其氨氮、硝酸鹽氮和磷的去除效率分別達(dá)到100%、15%和36%，顯著高于純藻系統(tǒng)的處理效果。Liang等[15]研究了地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) 與普通小球藻(Chlorellavulgaris) 共培養(yǎng)去除污水中氨氮，當(dāng)藻/菌細(xì)胞密度比為1∶1時(shí)，氨氮的去除率顯著提高到78%，而在相同條件下，單藻系統(tǒng)中氨氮的去除率為63%。Zhou等[16]利用小球藻和曲霉菌獲得的人工藻菌共生體進(jìn)行廢水處理，對氨氮、總氮、總磷和化學(xué)需氧量的去除率分別為100%、58.85%、89.83%、62.53%(濃縮液) 和23.23%、44.68%、84.70%、70.34%(稀釋豬糞廢水)。這些研究表明，藻菌共生體系可以有效提高微藻的生物量及油脂產(chǎn)量，同時(shí)將其應(yīng)用于廢水處理中具有良好的COD及氮磷去除效果，具有良好的應(yīng)用前景。

綜上，藻菌共生體系處理廢水的可行性已得到廣泛認(rèn)可，但目前的研究大多是利用藻菌共生體系處理市政污水以及畜禽養(yǎng)殖業(yè)廢水等，對于造紙廢水處理的相關(guān)研究甚少；且已有研究大多是通過在微藻培養(yǎng)體系中外源添加某類功能細(xì)菌來實(shí)現(xiàn)共生體系的構(gòu)建，而對于微藻生長過程自然形成的微生態(tài)體系中大量存在的細(xì)菌對微藻生長的影響研究并不系統(tǒng)。現(xiàn)將從棕鞭藻自養(yǎng)培養(yǎng)體系分離篩選出對微藻生長具有顯著促進(jìn)作用的微藻共棲細(xì)菌，通過確定最佳的藻菌投加比例以優(yōu)化藻菌共生體系，并探究其對造紙廢水的處理效果。以期為揭示微藻共棲細(xì)菌對藻細(xì)胞生長代謝的影響以及藻菌共生體系在造紙廢水深度處理的應(yīng)用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 廢水來源與分析方法

實(shí)驗(yàn)所用造紙廢水來源于陜西某造紙廠二沉池出水，經(jīng)紗布過濾除去懸浮固體物后測定其水質(zhì)。總氮和總磷濃度分別采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[17]與鉬酸銨分光光度法[18]測定；COD采用連華科技5B-6C多參數(shù)水質(zhì)測定儀測定；色度采用恩帆EFS-3D色度測定儀測定。造紙廢水水質(zhì)指標(biāo)如表1所示。

1.2 微藻的來源與培養(yǎng)

棕鞭藻屬(Ochromonassp. MN028526) 分離自陜西科技大學(xué)人工湖。利用BG11培養(yǎng)基[19]培養(yǎng)棕鞭藻，取BG11培養(yǎng)基100 mL并置于250 mL三角瓶中，接種藻株至棕鞭藻培養(yǎng)液OD540為0.2。將棕鞭藻培養(yǎng)液于光強(qiáng)3 000 lx、溫度28 ℃、光周期L∶D=14 h∶10 h、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

1.3 棕鞭藻共棲細(xì)菌分離、培養(yǎng)與鑒定

將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的棕鞭藻培養(yǎng)液用無菌水以1∶10的比例逐級稀釋，取100 μL稀釋至10-4～10-6的稀釋液，涂布至LB培養(yǎng)基(蛋白胨 10 g/L、牛肉膏 5 g/L、氯化鈉 10 g/L) 中，分離棕鞭藻的共棲細(xì)菌。將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中2～3 d，分離不同的菌落，多次劃線培養(yǎng)直至獲得單一、純凈的菌落。

利用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)分離獲得的共棲細(xì)菌，培養(yǎng)至穩(wěn)定期后1 000g離心，獲得菌株。利用細(xì)菌基因提取試劑盒(Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒) 提取細(xì)菌DNA。利用已提取的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCGA-3′) 和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增[20]。PCR反應(yīng)體系(25 μL) 為Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L的正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，加純水補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性3 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，29個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸5 min，最后12 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)核酸染料染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，使用膠回收試劑盒對混合后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化，將純化產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)菌宏基因組16S rDNA測序，測序區(qū)間為V3～V4可變區(qū)，測序平臺為Illumina MiseqTM，委托生工生物工程有限公司完成。將測序獲得的16S rRNA序列上傳至NCBI網(wǎng)站，進(jìn)行BLAST比對(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)，然后用MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4 構(gòu)建棕鞭藻與細(xì)菌的共培養(yǎng)體系

將分離獲得的細(xì)菌與微藻共培養(yǎng)，進(jìn)一步研究細(xì)菌對微藻生物量積累的影響。將棕鞭藻與分離獲得的細(xì)菌分別培養(yǎng)至對數(shù)期，8 000 r/min離心5 min后棄上清，按比例取適量加入到BG11培養(yǎng)基或廢水中振蕩培養(yǎng)。

1.5 棕鞭藻細(xì)胞葉綠素a含量的測定

取棕鞭藻藻液5 mL，10 000g離心5 min，棄上清；并將微藻細(xì)胞懸浮于5 mL 90%的甲醇溶液，75 ℃水浴5 min后，10 000g離心10 min。將上清液取出，以90%甲醇為對照，檢測相應(yīng)吸光度D(λ)(λ為波長)，再計(jì)算樣品中葉綠素a的濃度(CChla)[21]，計(jì)算公式為

CChla=16.82D(665)-9.28D(652)

2 結(jié)果與分析

2.1 棕鞭藻共棲細(xì)菌的分離

經(jīng)平板多次劃線篩選出5株細(xì)菌，編號為A～E(表2)。A、B、E三株細(xì)菌菌落為球形，表面光滑，邊緣整齊，菌落顏色分別為橙紅色、白色、乳白色；C菌落呈現(xiàn)扁平狀，表面粗糙，邊緣褶皺，為淡黃色；D菌落呈球形，表面光滑，邊緣整齊，乳白色。

表2 不同菌群形態(tài)Table 2 Morphology of different bacterial

2.2 棕鞭藻共棲細(xì)菌的鑒定

經(jīng)平板多次劃線篩選出5株細(xì)菌，將5株共棲細(xì)菌16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast對比，5株共棲細(xì)菌分別與卟啉桿菌屬(Porphyrobactersp.)、生絲單胞菌屬(Hyphomonassp.)、水單胞菌屬(Aquimonassp.)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacteriumsp.)，噬氫菌屬(Hydrogenophagasp.) 高度相似，進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。

圖1 棕鞭藻伴生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees of associated bacteria of Ochromonas

2.3 共棲細(xì)菌對微藻生長的影響

將培養(yǎng)到對數(shù)生長期的棕鞭藻與5株共棲菌分別以1∶1比例接種至BG11培養(yǎng)基，共培養(yǎng)10 d，監(jiān)測每天微藻葉綠素a濃度(圖2)。結(jié)果表明，在前4 d，除菌株D農(nóng)桿菌對微藻生長有抑制外，其他4組長勢基本相同；5 d后水單胞菌對微藻的生長開始出現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用，其他3株菌仍無較大影響。在5株共棲菌中，菌株C水單胞菌屬促微藻生長效果明顯，微藻葉綠素a含量在第10 d達(dá)到5.236 mg/L，比對照組葉綠素a含量增加了43.57%，此時(shí)微藻干重達(dá)到0.513 g/L。菌株D農(nóng)桿菌屬對棕鞭藻的生長有抑制作用，菌株A、B、E對棕鞭藻的生長效應(yīng)作用不明顯。據(jù)此，篩選出促進(jìn)微藻生長的優(yōu)勢促生菌株C菌種，即水單胞菌，用于棕鞭藻藻菌共生體系的構(gòu)建。

圖2 5株伴生菌對棕鞭藻生長的影響Fig.2 Effect of five bacteria on the growth of Ochromonas

2.4 棕鞭藻與水單胞菌共生體系的建立

建立棕鞭藻與水單胞菌共生體系，將藻菌以不同比例(10∶1、2∶1、1∶1、1∶3、1∶5) 配比接種至BG11培養(yǎng)基，共培養(yǎng)10 d，監(jiān)測其每日的葉綠素a變化情況。結(jié)果如圖3所示，可知葉綠素a含量總體出現(xiàn)先增高后逐漸平穩(wěn)的趨勢；與對照組相比可以看出，在這5種比例只要加入水單胞菌，就會對微藻的生長產(chǎn)生促進(jìn)作用，且隨著藻菌比的減小促進(jìn)作用出現(xiàn)先增高后降低的趨勢。當(dāng)藻菌比為1∶3時(shí)，葉綠素a含量增長最快，說明在這個(gè)比例下細(xì)菌對微藻的促進(jìn)作用最高；在第10 d時(shí)，葉綠素a含量達(dá)到7.975 mg/L，高出對照組葉綠素a含量112.23%，此時(shí)微藻產(chǎn)量干重為0.78 g/L。據(jù)此，選用棕鞭藻與水單胞菌以1∶3建立藻菌共生體系用于對造紙廢水處理的研究。

圖3 藻菌比對棕鞭藻葉綠素a含量的影響Fig.3 Effect of the ratio of algae to bacteria on the content of chlorophyll a in Ochromonas

2.5 造紙廢水對微藻生長的影響

將造紙廢水用不同比例純水稀釋(分別為原水、稀釋2倍廢水和稀釋5倍廢水)，滅菌后接入微藻培養(yǎng)物或藻菌共生培養(yǎng)物，培養(yǎng)8 d測其每日葉綠素a濃度。由圖4(a) 可知，微藻葉綠素a總體變化趨勢相似，在稀釋2倍廢水培養(yǎng)的藻菌共生體系中葉綠素a含量始終保持最佳，在培養(yǎng)第8 d時(shí)，葉綠素a含量高達(dá)10.952 mg/L，此時(shí)體系中微藻干重為1.073 g/L。從圖4(b) 中可以看出，相較于其他稀釋倍數(shù)，當(dāng)造紙廢水稀釋2倍時(shí)，純藻和藻菌共生體系中的微藻的生物量積累均處于更高的水平。與未經(jīng)稀釋的廢水體系相比，純藻和藻菌共生體系中微藻的葉綠素含量在第8 d分別高出36%和34.33%。結(jié)果說明稀釋2倍的造紙廢水中氮磷等營養(yǎng)條件更適宜微藻的生長，在該稀釋度下廢水中總氮、總磷濃度大約為11.21 mg/L和2.45 mg/L。需要特別指出的是，除純藻和藻菌共生體系在稀釋5倍廢水比生長速率基本相等外，其余兩組微藻在藻菌共生體系生長比純藻系統(tǒng)好，說明藻菌之間形成了良好的共生作用，此時(shí)細(xì)菌給棕鞭藻提供CO2進(jìn)行光合作用，同時(shí)細(xì)菌吸收棕鞭藻產(chǎn)生O2及其他有機(jī)物。

圖4 不同廢水稀釋度下藻菌生長情況Fig.4 Growth of algae and bacteria under different dilution of wastewater

2.6 藻菌共生體系處理造紙廢水的效果

為對比純藻、藻菌共生和純菌體系對造紙廢水的處理效果，將造紙廢水用純水稀釋2倍，滅菌后分別接入微藻培養(yǎng)物、藻菌共培養(yǎng)物和細(xì)菌培養(yǎng)物，培養(yǎng)8 d后計(jì)算體系內(nèi)COD、總氮量(total nitrogen,TN)、總磷量(total phosphorus,TP)及色度的去除效率。由圖5可知，藻菌共生體系對造紙廢水COD、TN、TP和色度的去除能力都顯著優(yōu)于純藻和純菌體系。藻菌共生體系對廢水COD的去除率達(dá)到75.67%，較純藻體系(去除率為63.13%) 和純菌體系(去除率為59%) 提高了近1.3倍；相較于前期課題組使用的芬頓法，去除造紙廢水COD效果相當(dāng)[22]，使用藻菌共生體系處理造紙廢水可大幅降低處理成本和提高環(huán)境效益，且微藻可用于后續(xù)生物柴油的開發(fā)利用，實(shí)現(xiàn)良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

對于TN的去除，相較于純藻體系(去除率為22.24%) 和純菌體系(去除率為28.53%)，藻菌共生體系中TN去除率可達(dá)到35.19%；純菌對TN的去除效率較純藻高，說明廢水體系中細(xì)菌對N源的吸收利用是影響藻菌共生體系處理總氮效率的關(guān)鍵因素之一。

圖5顯示單獨(dú)的細(xì)菌處理TP的去除率為30.96%，純藻體系和藻菌共生體系處理可使得TP去除率升高至75.21%和90.2%。這一結(jié)果可能是由于微藻不但可以直接吸收和利用無機(jī)鹽，還可以提高水中溶解氧濃度，促進(jìn)細(xì)菌的生長，從而加強(qiáng)有機(jī)質(zhì)分解，降低水中氮磷含量。因此，藻菌協(xié)同作用可以顯著促進(jìn)棕鞭藻對廢水中氮磷等的吸收。由圖5(b)可看出，藻菌共生體系對造紙廢水色度的去除能力顯著，處理8 d后，去除率高達(dá)93.45%。

圖5 不同體系對造紙廢水中COD、TN、TP色度去除效果Fig.5 Removal effect of different systems on COD, TN, TP and chroma in papermaking wastewater

3 結(jié)論

(1)分離純化獲得棕鞭藻(Ochromonassp. MN028526) 5株伴生細(xì)菌，經(jīng)16S rDNA基因測序，5株菌株分別為Porphyrobactersp.(卟啉桿菌屬)、Hyphomonassp.(生絲單胞菌屬)、Aquimonassp.(水單胞菌屬)、Agrobacteriumsp.(農(nóng)桿菌屬) 和Hydrogenophagasp.(噬氫菌屬)。

(2)水單胞菌(Aquimonassp.) 能明顯促進(jìn)微藻葉綠素a含量的增長，對微藻生物量積累促進(jìn)率可達(dá)43.57%。農(nóng)桿菌屬(Agrobacteriumsp.) 對棕鞭藻的生長有抑制作用，卟啉桿菌(Porphyrobactersp.)、生絲單胞菌(Hyphomonassp.)、噬氫菌(Hydrogenophagasp.) 對棕鞭藻無顯著影響。且當(dāng)棕鞭藻與水單胞菌的初始接種比例為1∶3時(shí)，細(xì)菌對微藻的促進(jìn)作用最佳，微藻干重最高可達(dá)0.78 g/L。

(3)水單胞菌與棕鞭藻藻菌共生體系對造紙廢水中COD、TN、TP及色度的去除效果顯著優(yōu)于純藻和純菌處理體系，去除率最高分別達(dá)75.67%、35.19%、90.2%和93.45%。