5-Fu在新一代結(jié)腸癌PDX模型中治療劑量的研究

劉 靖，陳 戰(zhàn)，李 鵬，李 迪，涂永久

結(jié)腸癌為臨床常見(jiàn)的消化類(lèi)疾病，屬于惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高[1]。早期結(jié)腸癌手術(shù)治療后5年生存率可達(dá)90%～95%，而晚期僅有5%[2]。因此，對(duì)于晚期結(jié)腸癌的病人，根治術(shù)治療已經(jīng)不再適合，臨床多用化療藥物來(lái)減小病灶、緩解癥狀，以達(dá)到延長(zhǎng)病人生存期、提高生活質(zhì)量的目的。新型化療藥物及靶向藥物不斷出現(xiàn)，但新藥在進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)過(guò)程中超過(guò)95%會(huì)被淘汰[3]，因此，更精準(zhǔn)的臨床前體內(nèi)試驗(yàn)是必要的。新一代動(dòng)物模型——病人來(lái)源腫瘤異種移植模型(patient-derived tumor xenografts，PDX)應(yīng)運(yùn)而生。PDX是將病人的腫瘤直接接種到高度免疫缺陷小鼠體內(nèi)而建立起來(lái)的動(dòng)物模型，該模型能夠保持原代腫瘤的異質(zhì)性、組織學(xué)特性、分子多樣性以及微環(huán)境，為評(píng)估藥效、解決臨床治療難題奠定研究基礎(chǔ)，是新型的有效的腫瘤研工具[4]。臨床常用的抗結(jié)腸癌藥物，如氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)、奧沙利鉑、吉西他濱和伊立替康等都有一定的不良反應(yīng)。其中，5-Fu常被用作陽(yáng)性藥對(duì)照來(lái)間接評(píng)價(jià)新藥的藥效，但不同研究者采用5-Fu作為陽(yáng)性藥時(shí)使用的藥物劑量不一，藥效與毒性差異很大。本研究對(duì)5-Fu在PDX模型中的藥效與毒性進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)5-Fu的藥效和毒性與給藥劑量之間的關(guān)系，以期為5-Fu在PDX模型中作為陽(yáng)性藥對(duì)照時(shí)的劑量選擇提供參考。現(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試劑與動(dòng)物 5-Fu為Sigma公司(美國(guó))產(chǎn)品。青霉素鏈霉素溶液、RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco公司(美國(guó))產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取SPF級(jí)雌性NCG小鼠(4～6 周齡，體質(zhì)量15～20 g)，SPF級(jí)雌性BALB/c裸鼠(6～7周齡，體質(zhì)量22～25 g)，均購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院[SCXK(蘇)2015-0001]，飼養(yǎng)于廈門(mén)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)屏障設(shè)施中[SYXK(閩)2018-0009]，環(huán)境溫度23～25 ℃，相對(duì)濕度40 %，12 h晝夜交替，飼料經(jīng)輻照處理，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理，動(dòng)物自由攝食和飲水。

1.2 樣本收集 腫瘤標(biāo)本來(lái)自廈門(mén)大學(xué)附屬成功醫(yī)院接受手術(shù)的結(jié)直腸癌病人，經(jīng)腸鏡病理明確診斷為結(jié)直腸癌，行手術(shù)切除結(jié)直腸癌病灶。經(jīng)過(guò)病人本人及家屬同意，僅供實(shí)驗(yàn)研究。病人新鮮的腫瘤組織命名為P0代。P0代組織應(yīng)在標(biāo)本離體30 min內(nèi)于手術(shù)室采集完成，避開(kāi)液化壞死區(qū)域，將腫瘤組織切成小塊，置于含1%青霉素鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，冰浴保存，用于構(gòu)建動(dòng)物模型。

1.3 PDX模型的建立 于超凈工作臺(tái)，用無(wú)菌器械去凈腫瘤周?chē)Y(jié)締組織和液化壞死區(qū)域，組織修剪成3 mm×3 mm×3 mm左右小塊，再用含1%青霉素鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次，每次約5 min。用75%乙醇消毒已麻醉的NCG小鼠側(cè)部皮膚，輕拉皮膚，套管針刺入皮下，輕推針心將組織塞入皮下，消毒穿刺點(diǎn)。種植部位發(fā)現(xiàn)明顯腫瘤生長(zhǎng)為種植成功(命名為P1代)，按照V=1/2×長(zhǎng)×寬2計(jì)算腫瘤體積，待腫瘤體積長(zhǎng)至1 000 mm3左右時(shí)無(wú)菌條件下頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并取腫瘤。病人來(lái)源腫瘤組織移植成瘤率關(guān)鍵環(huán)節(jié)，P1代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用高度免疫鼠NCG小鼠，有助于提高成瘤率。成瘤后，移植瘤的生長(zhǎng)就相對(duì)穩(wěn)定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)則改用BALB/c裸鼠作為動(dòng)物模型。同樣方法種植于BALB/c裸鼠，每例P1代腫瘤種植2只小鼠，種植部位發(fā)現(xiàn)明顯腫瘤生長(zhǎng)為種植成功(命名為P2代)。從P2代中選出生長(zhǎng)良好的荷瘤鼠腫瘤，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取各代組織，進(jìn)行基因分型及組織病理檢測(cè)，分析腫瘤組織的溯源性。

1.4 分組與給藥 將選取的荷瘤鼠腫瘤剪切成均勻的小塊，分別接種于裸鼠皮下。當(dāng)3代移植瘤(P3)增長(zhǎng)至約150 mm3時(shí)，選取瘤體大小均一的裸鼠30只，隨機(jī)分為6組(n=6)。空白對(duì)照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，另外5組分別腹腔注射5、10、20、40、60 mg/kg 5-Fu，每天1次，連續(xù)5 d。

1.5 觀察指標(biāo) 治療開(kāi)始后，每天觀察動(dòng)物一般狀況并記錄，間隔2 d測(cè)一次小鼠體質(zhì)量、腫瘤體積。游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下腫瘤的長(zhǎng)度記為(L)，寬度記為(W)，根據(jù)公式1/2 ×(W2×L)計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)瘤體積達(dá)到約2 000 mm3或飼養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48 d，無(wú)論哪個(gè)數(shù)據(jù)先達(dá)到即終止該組實(shí)驗(yàn)。分離各組腫瘤，稱(chēng)量瘤體質(zhì)量，計(jì)算抑制率。抑瘤率(%)=(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。摘取肺、脾、胸腺、肝稱(chēng)量質(zhì)量，分析各臟器變化。其中，脾(胸腺/肺/肝)指數(shù)(mg/10 g)=脾(胸腺/肺/肝)質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×10。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PDX建模情況 連續(xù)測(cè)定移植瘤體積，結(jié)果顯示PDX原代模型(P1)在接種后20 d左右成功形成瘤體，在接種部位觸及結(jié)節(jié)質(zhì)硬、活動(dòng)度差，49～56 d腫瘤體積可以達(dá)到傳代要求。腫瘤傳代后(P2)生長(zhǎng)速度明顯快于P1代(P<0.01)(見(jiàn)表1、圖1A)，符合腫瘤生長(zhǎng)的特點(diǎn)?；驒z測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)傳代后，腫瘤組織與病人術(shù)后P0代腫瘤組織同源性為99.96%。組織病理切片染色，也顯示各代腫瘤組織差異不大(見(jiàn)圖1B)。

表1 P1和P2代小鼠不同時(shí)間點(diǎn)移植瘤體積變化情況

2.2 5-Fu抗腫瘤效果 與空白對(duì)照組比較，5 mg/kg劑量組腫瘤體積增長(zhǎng)變緩(P<0.01)。10 mg/kg劑量組腫瘤體積抑制較5 mg/kg組更加明顯(P<0.01)，但瘤體未出現(xiàn)壞死。20 mg/kg劑量組腫瘤細(xì)胞主要聚集于腫瘤塊周?chē)?，中央的?xì)胞大部分壞死，有復(fù)發(fā)的趨勢(shì)。40 mg/kg劑量組與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)，較早出現(xiàn)壞死，與20 mg/kg劑量組比較壞死周邊無(wú)殘留瘤組織，繼而出現(xiàn)結(jié)痂，在39 d時(shí)出現(xiàn)治愈情況。60 mg/kg劑量組的腫瘤體積基本沒(méi)有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，抑制效果最顯著，但同時(shí)不良反應(yīng)也大，小鼠日漸消瘦，10 d內(nèi)出現(xiàn)死亡(見(jiàn)表2、圖2)。實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，剝離腫瘤稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算抑制率，5、10、20、40、60 mg/kg劑量組對(duì)應(yīng)的腫瘤抑制率分別為33%、49%、68%、92%和100%。

表2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積比較

2.3 5-Fu對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量和存活率的影響 隨5-Fu劑量增加，10、20、40、60 mg/kg劑量組小鼠體質(zhì)量變化率逐漸降低(P<0.01)(見(jiàn)表3)。40 mg/kg劑量組小鼠體質(zhì)量先下降，小鼠狀態(tài)較差、消瘦、活動(dòng)能力減弱，但后期有逐步恢復(fù)的趨勢(shì)。60 mg/kg劑量組小鼠體質(zhì)量急劇下降，出現(xiàn)嚴(yán)重便秘現(xiàn)象，在12 d就開(kāi)始出現(xiàn)死亡，在21 d全組小鼠均死亡，死亡率為100%。

表3 各組小鼠體質(zhì)量變化情況比較

2.4 5-Fu對(duì)荷瘤小鼠各組織毒性 5、10 mg/kg組小鼠肺、脾、胸腺和肝指數(shù)與空白對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；20 mg/kg組小鼠脾指數(shù)明顯高于空白對(duì)照組，胸腺指數(shù)明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01)；40 mg/kg組小鼠肺、脾、胸腺和肝指數(shù)與空白對(duì)照組、20 mg/kg組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)(見(jiàn)表4)。

表4 各組小鼠各臟器質(zhì)量指數(shù)比較

3 討論

PDX模型較好地保持了原發(fā)性瘤中大多數(shù)的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路活性，能夠更好地模擬腫瘤病人親本基因?qū)W特征，且不同腫瘤病人來(lái)源的 PDX 模型其生物學(xué)和遺傳學(xué)特性會(huì)有所不同，恰好滿足靶向藥物篩選和個(gè)體化治療的要求[5]。因此，PDX 模型的應(yīng)用具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

傳統(tǒng)評(píng)價(jià)新藥藥效的體內(nèi)試驗(yàn)，模型常選用腫瘤細(xì)胞株異種移植模型，化療方案的陽(yáng)性對(duì)照藥物常選用5-Fu。但是，不同劑量的5-Fu所表現(xiàn)的藥效與毒性差異很大，若試驗(yàn)中選用的劑量不合適，可能會(huì)因藥效不好或毒性過(guò)大引起動(dòng)物死亡率過(guò)高進(jìn)而發(fā)揮不了陽(yáng)性藥的對(duì)照效果。

已有報(bào)道[6]對(duì)5-Fu在小鼠結(jié)腸癌模型中的藥效與毒性做了研究，為該藥作為陽(yáng)性藥時(shí)的劑量選擇提供參考。朱磊等[7]在人結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26裸鼠結(jié)腸癌模型中采用5-Fu作為陽(yáng)性藥，其劑量為20 mg/kg，灌胃給藥，每天1次，周期10 d。CUSACK等[8]在人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo裸鼠結(jié)腸癌模型中采用5-Fu作為陽(yáng)性藥，其劑量為33 mg/kg，腹腔注射，每周2次，周期為32 d。CIOMEI等[9]在人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116裸鼠腫瘤模型研究中采用了50 mg/kg的劑量。HARRIS等[10]在人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29 裸鼠腫瘤模型研究中采用了65 mg/kg的劑量。不同文獻(xiàn)報(bào)道的劑量、給藥方式、給藥周期等都各有差異。但是，在新一代模型——PDX模型上尚未有研究。

本研究首次探討5-Fu在PDX模型中的適宜用量，結(jié)果顯示，模型動(dòng)物的抑瘤效果與5-Fu的劑量關(guān)系密切，毒性也是如此。60 mg/kg高劑量表現(xiàn)為高毒性，模型動(dòng)物出現(xiàn)死亡，不適合應(yīng)用。40 mg/kg抑瘤效果好，但毒性也較大，預(yù)測(cè)動(dòng)物需要有一段時(shí)間的機(jī)體機(jī)能恢復(fù)期。20 mg/kg劑量抑瘤效果好，毒性小，模型動(dòng)物體質(zhì)量、組織變化小，尤其是對(duì)免疫系統(tǒng)——脾、胸腺及肝臟等組織影響小。根據(jù)本研究結(jié)果，推測(cè)在用藥療程上做細(xì)致研究，有望達(dá)到治愈療效。而10 mg/kg劑量有抑制效果，但較20 mg/kg劑量療效弱。

綜上，10～20 mg /kg 劑量的5-Fu較適合于PDX模型的藥效評(píng)價(jià)，可為其他PDX模型應(yīng)用5-Fu治療時(shí)提供用藥參考。