伸筋易骨法調(diào)控家兔軟骨細(xì)胞增殖減輕軟骨變性的實驗研究*

王一洲，趙強

（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院推拿科，天津 300120）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是以關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨變性為主要特征的退行性骨關(guān)節(jié)病，是最常見的下肢致痛因素之一，隨著病情的發(fā)展，KOA還會進一步引起下肢功能障礙、關(guān)節(jié)畸形等癥狀，據(jù)統(tǒng)計KOA已成為致殘率最高的退行性骨關(guān)節(jié)疾患[1]。KOA的主要病理表現(xiàn)是軟骨平滑性的破壞，以及由此導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)重構(gòu)，軟骨細(xì)胞異常增殖和肥大化是造成這一病理表現(xiàn)的主要原因[2]。軟骨細(xì)胞的主要功能是維持細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白和蛋白聚糖的平衡，軟骨細(xì)胞的異常增殖和肥大化將會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，啟動并逐漸加重KOA病理進程[3-4]。甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）對軟骨細(xì)胞增殖的調(diào)控具有重要意義，當(dāng)KOA發(fā)生時，增生的軟骨細(xì)胞分泌PTHrP，抑制軟骨細(xì)胞終末化并穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，這一調(diào)控過程通過軟骨細(xì)胞表面的機械門控鈣通道級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-7]。課題組前期初步探索并發(fā)現(xiàn)：KOA引起的關(guān)節(jié)力學(xué)重構(gòu)影響機械敏感離子通道活化，伸筋易骨法能夠改善關(guān)節(jié)周圍軟組織性能，提高鈣通道活性，增加軟骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，刺激成骨標(biāo)志蛋白SOX9的表達，促進軟骨合成代謝[8-11]。PTHrP作為驅(qū)動軟骨增殖的重要因子，探討其在伸筋易骨法調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖中的作用具有一定意義。筆者應(yīng)用改良的Hulth造模法制備KOA兔模型，比較伸筋易骨法和玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔注射治療的作用效果，觀察伸筋易骨法調(diào)控PTHrP，影響軟骨增殖的超微結(jié)構(gòu)變化。

1 材料與方法

1.1 試劑 超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture（With ROX）、DNase 1、5×RNA Loading Buffer（康為世紀(jì)，中國）；戊二醛、丙酮、EPON812環(huán)氧樹脂（淮南市科迪化工科技有限公司，中國）；四氧化鋨、二甲砷酸鈉、多聚甲醛（南京化學(xué)試劑股份有限公司，中國）；醋酸雙氧鈾（EMS公司，美國）；檸檬酸鉛（上海鼓臣生物技術(shù)有限公司，中國）；超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture（With ROX）、DNase 1、5×RNA Loading Buffer（康為世紀(jì)，中國）。

1.2 儀器 ABI7500型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國）；NANODROP 2000型分光光度計（Therno scientific，美國）；QL-902型螺旋震蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，中國）；超薄切片機（Leica公司，德國）；Tecnai G2透射電子顯微鏡（FEI公司，美國）；低溫高速離心機（Beckman公司，美國）；JSM-7800F型超高分辨熱場發(fā)射掃描電鏡（JEOL公司，日本）；LyoQuest Plus-55型冷凍干燥機（Telstar公司，西班牙）。

1.3 模型制備[12]1）兔稱質(zhì)量后，無菌條件下，后腿上方靠近尾部脫毛，常規(guī)皮膚消毒，3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉。2）仰臥固定，備皮，鋪巾。3）內(nèi)側(cè)支持韌帶外緣打開1 cm窗口，逐層分離打開關(guān)節(jié)。4）分離脛側(cè)副韌帶并切斷，剪除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶，避免損傷關(guān)節(jié)軟骨。5）逐層縫合。6）術(shù)后連續(xù)3 d青霉素20萬U肌肉注射抗感染治療，1周后開始單通道小動物跑臺強迫兔活動 0.5 h，連續(xù) 30 d。

假手術(shù)組按照上述方法操作。

模型評價：Lysholm評分、步態(tài)足印分析等方法檢測造模成果。

1.4 治療方法 推拿組操作：1）在助手的協(xié)助下使兔保持仰臥位，先以指揉法沿股直肌、股外側(cè)肌、股內(nèi)側(cè)肌自下而上行5次操作，將兔下肢屈髖屈膝外展位擺放，以指按法操作于內(nèi)外膝眼，并向上、向中間推擠髕骨1 min。2）以食指和拇指相對用力，夾持大腿前面肌群，模擬叩揉法自下而上操作5次，以推法沿髂脛束平推5次。3）使兔患肢曲髖屈膝，術(shù)者一手握持小腿末端，一手拇指向外側(cè)撥髕骨，配合膝關(guān)節(jié)的屈伸5次，順時針搖膝5次，踝關(guān)節(jié)跖屈位牽拉膝關(guān)節(jié)5次。4）提拿髕骨1 min，結(jié)束手法。以上手法治療，每日1次，7 d為1個療程，共治療3個療程。

玻璃酸鈉注射組操作：1）仰臥位固定下肢，常規(guī)備皮、鋪巾。2）沿髕骨內(nèi)緣中點進針，針尖突破關(guān)節(jié)腔后稍后撤，注入玻璃酸鈉注射液2 mL，屈伸關(guān)節(jié)并研磨髕骨使藥液均勻分布。3）傷口敷料，每周1次，共注射3次。

1.5 組織樣本提取及標(biāo)本制作 空氣栓處死，逐層分離關(guān)節(jié)腔，清理半月板、韌帶等附著組織，手術(shù)刀刮取關(guān)節(jié)軟骨，磷酸鹽緩沖液（PBS）加壓沖洗3遍，正面向上貼敷于載玻片。掃描電鏡標(biāo)本于4%多聚甲醛4℃避光過夜，乙醇脫水后醋酸異戊酯置換，F(xiàn)-13臨界溫度干燥，鍍金，待上機檢測。透射電鏡檢測標(biāo)本用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm塊狀，放入2.5%戊二醛和2%的多聚甲醛混合液中（pH=7.4）固定過夜；吸出固定液，0.15 mol/L二甲砷酸鈉沖洗3遍，加入1%四氧化鋨（pH值7.4），固定2 h，棄液，沖洗；丙酮梯度脫水，依次放入 3∶1、1∶1、1∶3 EPON812環(huán)氧樹脂混合液中，棄液，沖洗；100%環(huán)氧樹脂滲透過夜；加入1.5%的加速劑，混勻。環(huán)氧樹脂包埋，烘烤，聚合。Leica EM UC6超薄切片機進行超薄切片，每片厚度為70 nm。2%醋酸雙氧鈾溶液染色，沖洗；再用2%檸檬酸鉛溶液染色，沖洗1 min，晾干。將制備好的超薄切片載網(wǎng)在透射電子顯微鏡FEI Tecnai Spirit 120 kv中進行觀察，成像。

1.6 PTHrP mRNA的檢測 1）用超純RNA提取試劑提取組織樣本中總RNA。2）取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性。3）將RNA模板、引物、5×RT Buffer和RNase-freeWater溶解并置于冰上備用。4）向反應(yīng)管中加入20 μL反應(yīng)體系進行反轉(zhuǎn)錄。5）用ABI 7500型熒光定量PCR儀，設(shè)定反應(yīng)條件為：預(yù)變性：95℃10 s，95℃5 s，60℃34 s，40個循環(huán)。每對引物設(shè)3個復(fù)孔。6）結(jié)果用 ABIPRISM7500 分析。引物：PTHrP-F（5′-AGAAGAAG AAGCGGCGAACT-3′），PTHrP-R（5′-CAATGCCTC CGTGAATCGAG-3′）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組軟骨組織中PTHrP mRNA的濃度比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察顯示 正常組軟骨組織和假手術(shù)組軟骨組織表面有壟溝排列有序的波浪形明暗帶，組織表面無纖維裸露，無血管和細(xì)胞分布；模型組表面壟溝樣明暗帶明顯紊亂，箭頭所指處可見裸露的膠原纖維和軟骨基質(zhì)，大量軟骨細(xì)胞暴露在軟骨表面；推拿組和玻璃酸鈉組軟骨表面有少量的膠原裸露，但壟溝樣明暗帶排列有序，箭頭所指處可見纖維裸露部分有縱向纖維爬過表面，提示軟骨修復(fù)。見圖1。

2.2 透射電鏡觀察顯示 正常組軟骨細(xì)胞和假手術(shù)組軟骨細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞內(nèi)以常染色質(zhì)為主，細(xì)胞核形態(tài)正常，胞質(zhì)內(nèi)少量脂滴，大量線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器圍繞核周，膠原纖維致密且排列規(guī)整；模型組軟骨細(xì)胞形態(tài)肥大，細(xì)胞質(zhì)凝聚于核膜，細(xì)胞核偏移，高爾基體擴張，箭頭所指處可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)異常，核膜上多個膜孔，線粒體消失，膠原纖維斷裂；推拿組和玻璃酸鈉組軟骨細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)扁平，核偏移，細(xì)胞器減少，但可見正常形態(tài)的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，箭頭所指處可見線粒體雙模結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞內(nèi)可見多個自噬小體。見圖2。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測各組軟骨組織PTHrP mRNA的表達 RT-PCR法檢測各組軟骨組織PTHrPmRNA的表達，假手術(shù)組與正常組PTHrPmRNA的表達比較，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；模型組與正常組比較，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；推拿組、玻璃酸鈉組與模型組比較，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；推拿組與玻璃酸鈉組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；推拿組、玻璃酸鈉組與正常組相比，具有顯著性差異（P＜0.05）。提示推拿手法與玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔注射均能促進PTHrP mRNA的表達，刺激軟骨增殖，抑制軟骨肥大化。見表1。

3 討論

中醫(yī)學(xué)將KOA歸屬于“骨痹”“筋痹”等范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)·長刺節(jié)論》描述筋痹有“筋孿節(jié)痛，不可以行”的癥狀，強調(diào)KOA發(fā)病早期肌肉張力發(fā)生變化，并伴隨疼痛和活動功能障礙。當(dāng)疾病逐漸進展，癥狀發(fā)展為“骨重不可舉，骨髓酸痛”之骨痹，此時，關(guān)節(jié)周圍軟組織性能整體下降并出現(xiàn)軟骨下骨硬化，以關(guān)節(jié)酸痛為主要癥狀的骨重構(gòu)是這一時期的典型表現(xiàn)。伸筋易骨法是趙強主任傳承古法并結(jié)合其臨床經(jīng)驗逐漸總結(jié)出的KOA保守治療方案，其中獨創(chuàng)的推拿手法包括屈膝點按、推搖牽擠、抱膝叩揉等，整套手法以增強肌肉性能、調(diào)節(jié)滑膜炎性內(nèi)環(huán)境、促進軟骨增殖為主要目的，通過點按激痛點促進筋膜內(nèi)炎性致痛物質(zhì)釋放，緩解局部代謝障礙，增強肌肉力學(xué)性能。通過推搖牽擠等運動關(guān)節(jié)類手法，多軸拉伸關(guān)節(jié)滑膜，調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞響應(yīng)應(yīng)力刺激，減輕滑膜內(nèi)炎性反應(yīng)。整套手法緩急兼顧、動靜結(jié)合，從KOA發(fā)病的各個環(huán)節(jié)切入，整體調(diào)控軟骨組織的增殖和修復(fù)。

圖1 各組軟骨組織掃描電鏡觀察（×1 000）Fig.1 Scanning electron microscope observation of cartilage tissues in each group（×1 000）

圖2 各組軟骨細(xì)胞透射電鏡觀察Fig.2 Transmission electron microscope observation of chondrocytes in each group

表1 各組軟骨組織PTHrP mRNA的表達（±s）Tab.1 Expression of PTHrP mRNA in cartilage tissues in each group（±s）

表1 各組軟骨組織PTHrP mRNA的表達（±s）Tab.1 Expression of PTHrP mRNA in cartilage tissues in each group（±s）

注：與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比 #P＜0.05。

組別 動物數(shù) PTHrP mRNA正常組 10 1.59±0.14假手術(shù)組 10 1.63±0.11模型組 10 1.04±0.10*推拿組 10 1.83±0.17*#玻璃酸鈉組 10 1.79±0.21*#

軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡是維持軟骨組織性能的重要因素，研究發(fā)現(xiàn)，不同強度機械刺激能夠誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖狀態(tài)發(fā)生變化，軟骨細(xì)胞將機械信號整合并調(diào)控其生理功能[13]。PTHrP在成骨細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞中均高表達，其通過激活磷脂酶 C（PLC）/蛋白激酶 C（PKC）通路抑制軟骨細(xì)胞肥大化并促進軟骨正常增殖[14]，PTHrP已被證實為軟骨增殖的潛在靶向分子。KOA早期大量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞侵入滑膜并釋放炎癥因子，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等通過不同途徑活化MMPs，其中MMP13過表達將導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原分解，引起軟骨重構(gòu)，Wang等[15]發(fā)現(xiàn)PTHrP能夠抑制軟骨組織中MMP-13進而增加Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的表達，維持軟骨結(jié)構(gòu)，促進細(xì)胞增殖。PTHrP的表達具有明顯的機械依賴性，軟骨細(xì)胞通過細(xì)胞外基質(zhì)感受表面應(yīng)力刺激，當(dāng)KOA發(fā)生時，關(guān)節(jié)周圍肌肉的力學(xué)性能首先發(fā)生減退，進而影響髕股關(guān)節(jié)、脛股平臺的理想物理環(huán)境，軟骨表面出現(xiàn)應(yīng)力集中，軟骨細(xì)胞中的PTHrP明顯降低[16]，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞肥大化和細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)[17]，這與實驗中觀察到的模型組軟骨細(xì)胞PTHrP mRNA表達降低相符。KOA早期，肥大前軟骨細(xì)胞能夠刺激增殖軟骨細(xì)胞分泌PTHrP以維持其祖細(xì)胞特性，抑制軟骨終末化趨勢，本研究掃描電鏡觀察中亦發(fā)現(xiàn)通過推拿組軟骨細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體形態(tài)恢復(fù)正常，斷裂的膠原纖維修復(fù)，初步證明推拿手法調(diào)控關(guān)節(jié)應(yīng)力促進軟骨細(xì)胞增殖和修復(fù)，緩解軟骨損傷。限于研究深度和探索領(lǐng)域，本研究僅得出部分伸筋易骨法干預(yù)KOA的作用機制，未來將從肌肉、滑膜等膝關(guān)節(jié)周圍軟組織的力學(xué)性能角度完善我們的研究，為KOA防治技術(shù)的發(fā)展做出貢獻。