2種中藥復(fù)方聯(lián)合植物乳桿菌對(duì)抗生素相關(guān)性腹瀉的緩解作用

郭 新，閆子鵬，李光輝，孟錦鑫，韓艷君，孫子龍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

抗生素已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物各種疾病的預(yù)防和治療中，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展也起到了一定的促進(jìn)作用。然而，濫用或過(guò)量使用抗生素將會(huì)導(dǎo)致抗生素耐藥性、細(xì)菌易感性和反復(fù)感染的風(fēng)險(xiǎn)增加，威脅人體健康和生態(tài)環(huán)境安全[1]?？股叵嚓P(guān)性腹瀉是大多數(shù)抗生素長(zhǎng)期應(yīng)用的常見(jiàn)并發(fā)癥，特別是廣譜抗生素，如克林霉素、β-內(nèi)酰胺類(lèi)和第三代頭孢菌素[2-3]。腹瀉經(jīng)常發(fā)生在豬、羊等養(yǎng)殖場(chǎng)，發(fā)病速度快、病程短，必須及時(shí)進(jìn)行診斷和治療，否則將會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物大量死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

中藥因其具有安全、高效、低毒、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物疫病防控中發(fā)揮著越來(lái)越大的作用[5]。微生物發(fā)酵是中藥材的重要炮制手段之一，運(yùn)用發(fā)酵的手段對(duì)中藥材進(jìn)行處理，借助微生物與酶的作用，在一定的環(huán)境下，通過(guò)發(fā)酵可以改變其原有的性能，增強(qiáng)或產(chǎn)生新的功效，擴(kuò)大治療范圍[6-8]。同時(shí)，發(fā)酵中藥還可以節(jié)省藥材資源，保護(hù)環(huán)境，增加中藥制劑的安全性以及質(zhì)量控制[9]。

近年來(lái)，有很多研究顯示乳酸菌（Lactobacillus）在畜牧生產(chǎn)中以及中藥發(fā)酵中起著重要的作用，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的保健以及疾病的治療都有很好的效果。如在青貯飼料的發(fā)酵過(guò)程中添加乳酸菌，不僅可以有效地抑制有害菌的繁殖，而且也改善了飼料的發(fā)酵品質(zhì)[10]。乳酸菌發(fā)酵黃芪多糖制劑應(yīng)用在肉雞養(yǎng)殖上，可以提高肉雞的生長(zhǎng)性能、改善肉雞腸道的微生物體系[11]。

本研究通過(guò)植物乳桿菌發(fā)酵補(bǔ)中益氣湯和參苓白術(shù)湯，對(duì)小鼠稀便率、腸道形態(tài)、腸屏障功能相關(guān)基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在通過(guò)利用中藥、益生菌或發(fā)酵中藥減輕由抗生素引起的腹瀉的研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)對(duì)象 無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)體質(zhì)量大小一致、健康的雄性ICR 小鼠（3 周齡）189 只，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 藥物和試劑 補(bǔ)中益氣湯（BZYQ）是由炙黃芪、黨參、炒白術(shù)、炙甘草、當(dāng)歸、陳皮、升麻、柴胡8 味中藥組成；參苓白術(shù)湯（SLBZ）是由黨參、茯苓、炒白術(shù)、山藥、炙甘草、炒白扁豆、蓮子、炒薏苡仁、砂仁、桔梗、陳皮11 味中藥組成，藥材購(gòu)自北京同仁堂藥店；頭孢曲松鈉購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，植物乳桿菌CICC 21809 購(gòu)自中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司；Trizol、PrimeScriptTM試劑盒和SYBRRPremix Ex TaqTMII 試劑盒均購(gòu)自大連Takara公司；蘇木精-伊紅染色試劑盒、無(wú)水乙醇、二甲苯、中性樹(shù)脂均自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、生物組織包埋機(jī)（金華惠友儀器設(shè)備有限公司）、生物組織切片機(jī)（德國(guó)Leica 儀器設(shè)備有限公司）、生物組織攤烤片機(jī)（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）、生物顯微鏡（日本Olympus 公司）、高精度移液槍?zhuān)ǖ聡?guó)Eppendorf 公司）、超凈工作臺(tái)（北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化工程公司）、ND-2000 核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)NanoDrop 公司）、Mx3000P 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Stratagene 公司）。

1.1.4 中藥、菌液與發(fā)酵中藥 按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》[12]中的比例稱(chēng)取1.1.2 中藥材，加蒸餾水浸泡1 h，煎煮2 次，每次45 min，過(guò)濾去渣，合并濃縮藥液為1 g/mL；使用食品級(jí)碳酸鈉將pH 值調(diào)至6.5，即制得補(bǔ)中益氣湯和參苓白術(shù)湯。將植物乳桿菌菌株接種到已滅菌的乳酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基（MRS）中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，制得益生菌液（LP），并將其以3%的接種量分別接種到補(bǔ)中益氣湯和參苓白術(shù)湯中，在37 ℃下發(fā)酵24 h，以達(dá)到107cfu/mL。即制得補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵液（FBZYQ）和參苓白術(shù)湯發(fā)酵液（FSLBZ）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，小鼠隨機(jī)分成7 組，每組8 只，重復(fù)3 次。在空白對(duì)照組（BC）中，每天分別在9：00 和13：00 給小鼠灌胃0.3 mL 生理鹽水2 次；在頭孢曲松鈉組（CS，4 g/（kg·d））中，分別在9：00 和13：00 灌胃給小鼠0.3 mL 頭孢曲松鈉溶液和0.3 mL 生理鹽水；對(duì)于頭孢曲松鈉＋益生菌組（CS＋LP）、頭孢曲松鈉＋補(bǔ)中益氣湯組（CS＋BZYQ）、頭孢曲松鈉＋參苓白術(shù)湯組（CS＋SLBZ）、頭孢曲松鈉＋補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵液組（CS＋FBZYQ）和頭孢曲松鈉＋參苓白術(shù)湯發(fā)酵液組（CS＋FSLBZ），分別于9：00 和13：00 通過(guò)灌胃給予小鼠0.3 mL 頭孢曲松鈉溶液和相應(yīng)的0.3 mL 藥液。各組小鼠單獨(dú)分籠飼養(yǎng)，連續(xù)處理治療7 d，試驗(yàn)期間各組飼養(yǎng)管理?xiàng)l件完全一致。在第1、4、7 d，分別記錄小鼠精神狀態(tài)和排便情況，在第8 天，對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，將腸組織儲(chǔ)存在-80 ℃條件下，后續(xù)進(jìn)行qRT-PCR。每組3 個(gè)樣品固定在4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行腸道組織病理學(xué)觀察。

1.2.2 稀便率測(cè)定 在13：00 灌胃2 h 內(nèi)，分別統(tǒng)計(jì)每只小鼠的稀便數(shù)和總便數(shù)。稀便率為2 h 內(nèi)每只小鼠所排稀便數(shù)與總便數(shù)的比值。

1.2.3 石蠟切片的制作及蘇木精-伊紅（HE）染色

將固定好的組織沿橫截面切成1 cm 左右的管狀，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋，使用切片機(jī)切成5 μm 厚的切片，攤片，烤片，之后用于HE 染色。

將制得的切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后；蘇木精染色，分化液分化，自來(lái)水沖洗藍(lán)化；再進(jìn)行梯度酒精脫水；然后伊紅染色；高濃度酒精脫水，二甲苯透明，最后中性樹(shù)膠封片，制得HE 染色切片。晾干后在顯微鏡下觀察各組小鼠十二指腸、空腸和回腸組織情況，并拍照保存。

1.2.4 十二指腸和結(jié)腸基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

1.2.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 由Primer 3.0 plus 設(shè)計(jì)的內(nèi)參基因和目的基因的序列為GAPDH、AQP8和Claudin-1（表1），引物均由生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.4.2 RNA 提取和qRT-PCR 將0.5～1.0 cm 的十二指腸和結(jié)腸組織剪碎，將其加到1 mL 的Trizol中進(jìn)行RNA 提取。RNA 的質(zhì)量用核酸蛋白濃度測(cè)定儀（ND-2000）鑒定；然后使用PrimeScriptTM試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，使用SYBRRPremix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃30 s；PCR 反應(yīng)95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s；溶解曲線分析95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，并重復(fù)40 個(gè)周期。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。稀便率和基因相對(duì)表達(dá)水平采用方差分析（ANOVA），用Tukey's進(jìn)行檢驗(yàn)（P＜0.05 為差異顯著）。將GAPDH 作為內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt法得出目的基因AQP8 和Claudin-1 的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠精神狀態(tài)觀察

試驗(yàn)前，小鼠活潑好動(dòng)，糞便正常；造模后，小鼠表現(xiàn)腹瀉、稀便、精神萎靡，毛色光澤度較差；而治療后上述癥狀有所緩解。

2.2 不同處理組小鼠稀便率的變化

從圖1 可以看出，與對(duì)照組相比，在第1、4、7 天頭孢曲松鈉組的小鼠稀便率均顯著上升（P＜0.05），表明模型成功建立。其中，第1 天，除益生菌組外，其他給藥組小鼠的稀便率與頭孢曲松鈉組相比均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；第4 天，除參苓白術(shù)湯組外，其他給藥小鼠的稀便率與頭孢曲松鈉組相比均顯著下降（P＜0.05）；第7 天，與頭孢曲松鈉組相比，發(fā)酵組小鼠稀便率顯著性下降（P＜0.05），且補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵液組和參苓白術(shù)湯發(fā)酵液組的稀便率從第4～7 天持續(xù)顯著下降（P＜0.05）。

2.3 不同處理組小鼠小腸的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

各組小鼠小腸形態(tài)如圖2、3、4 所示，可以觀察到對(duì)照組小鼠的十二指腸、空腸和回腸3 種小腸絨毛結(jié)構(gòu)正常，絨毛與隱窩界限分明，基本完好，無(wú)明顯的病理變化（圖2-A、3-A、4-A）；而頭孢曲松鈉處理引起小鼠的十二指腸、空腸和回腸的腸黏膜損傷，表現(xiàn)出短而寬的絨毛，深的隱窩，不完整和斷裂、脫落的結(jié)構(gòu)等病理變化（圖2-B、3-B、4-B）；其他各個(gè)給藥組均有不同程度的緩解效果，排列較為整齊緊密，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。且發(fā)酵組的絨毛較長(zhǎng)，緩解效果最好。

2.4 不同處理組小鼠十二指腸和結(jié)腸的基因表達(dá)量分析

各組小鼠的水通道蛋白AQP8 和緊密連接蛋白Claudin-1 在十二指腸和結(jié)腸中的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平如圖5、6 所示，在十二指腸中，與對(duì)照組相比，頭孢曲松鈉組的AQP8 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；與頭孢曲松鈉組相比，除參苓白術(shù)湯組，其他給藥組的AQP8 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均顯著上升（P＜0.05）；相比頭孢曲松鈉組，補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵液組的Claudin-1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），其他處理組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。在結(jié)腸中，與對(duì)照組和益生菌組相比，頭孢曲松鈉組的AQP8 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），盡管其他給藥組都有上升趨勢(shì)，但差異均不顯著（P＞0.05）；同時(shí)Claudin-1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量各處理組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3 結(jié)論與討論

為了觀察中藥、益生菌和發(fā)酵中藥對(duì)抗生素相關(guān)性腹瀉的緩解作用，本研究通過(guò)灌胃頭孢曲松鈉成功建立了小鼠腹瀉模型，它是廣譜的第三代頭孢菌素，廣泛用于治療胃腸道感染，但是重復(fù)使用會(huì)破壞腸道菌群的平衡，并引起腹瀉等副作用[12]。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，益生菌可以有效地恢復(fù)和平衡腸道菌群，預(yù)防和治療抗生素引起的腹瀉[13]。郭元晟等[14]研究結(jié)果表明，乳酸桿菌可以促進(jìn)肉雞小腸絨毛的生長(zhǎng)發(fā)育，改善小腸的黏膜結(jié)構(gòu)。還有一些研究發(fā)現(xiàn)，脾胃虛弱類(lèi)型的比例在抗生素相關(guān)性腹瀉患者中最大，因此，在臨床藥物和日常飲食中，補(bǔ)氣、益氣類(lèi)中藥被用于治療腸道疾病、增強(qiáng)免疫力、緩解疲勞和延長(zhǎng)壽命等[15]。補(bǔ)中益氣湯、參苓白術(shù)湯作為經(jīng)典的健脾益氣、澀腸止瀉方劑，經(jīng)常被用來(lái)治療脾胃虛弱、腹瀉等[16-17]。在本研究中，用中藥、益生菌和發(fā)酵中藥連續(xù)治療7 d 后，腹瀉小鼠稀便率顯著下降，其中，補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵液和參苓白術(shù)湯發(fā)酵液有持續(xù)緩解腹瀉效果，表明發(fā)酵具有一定的優(yōu)勢(shì)。

腸道是重要的內(nèi)臟器官之一，不僅可以消化和吸收營(yíng)養(yǎng)，還可以保護(hù)人體免受病原微生物的侵害。在本研究中，通過(guò)HE 染色觀察發(fā)現(xiàn)，頭孢曲松鈉組小鼠小腸絨毛受損，短而寬，出現(xiàn)不完整和斷裂、脫落的結(jié)構(gòu)，表明小腸的吸收功能和屏障功能受到嚴(yán)重?fù)p害[18]。小鼠腹瀉后，腸道中的水分增加，糞便軟化，在一定程度上刺激腸道黏膜，從而引起黏膜損傷。研究表明，中藥在治療腸黏膜屏障功能障礙中具有明顯的優(yōu)勢(shì)[19]。小鼠灌服中藥、益生菌和發(fā)酵中藥后，腸絨毛損傷較輕，說(shuō)明它們能夠減輕腹瀉對(duì)腸黏膜的刺激，對(duì)腸絨毛的完整性起到一定的保護(hù)作用。

腸上皮細(xì)胞通過(guò)緊密連接蛋白連接，從而調(diào)節(jié)腸道屏障通透性和上皮完整性。因此，緊密連接蛋白的穩(wěn)態(tài)表達(dá)對(duì)于維持人類(lèi)和動(dòng)物健康至關(guān)重要[20]，其中，Claudin-1 是緊密連接結(jié)構(gòu)中最關(guān)鍵的組成部分之一[21]。水通道蛋白（AQP）主要在胃腸道中表達(dá)，并且在一些生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22]，且遠(yuǎn)端小腸和近端結(jié)腸是AQP8 表達(dá)的主要部位[23]。張文娣等[24]觀察顯示，與抗生素相關(guān)的腹瀉大鼠表現(xiàn)出胃腸道完整性下降和上皮組織不良，與對(duì)照組相比，水通道蛋白編碼基因、緊密連接蛋白異常表達(dá)和杯狀細(xì)胞數(shù)量減少。同樣地，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腹瀉小鼠的十二指腸和結(jié)腸中的AQP8 mRNA 表達(dá)水平顯著降低。在給予益生菌、補(bǔ)中益氣湯和補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵液和參苓白術(shù)湯發(fā)酵液的小鼠中，AQP8 mRNA 表達(dá)水平得到了增強(qiáng)，十二指腸效果更明顯。Claudin-1 mRNA 表達(dá)水平在補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵液中顯著上升。這些結(jié)果大致與觀察到的腸道形態(tài)結(jié)果一致，表明中藥、益生菌和發(fā)酵中藥在分子水平上顯示出有益的特性。

本研究結(jié)果表明，頭孢曲松鈉引起了腹瀉，導(dǎo)致了短而寬的絨毛以及腸結(jié)構(gòu)的不完整和破裂，并且與腸屏障功能相關(guān)基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 表達(dá)下降。但是，中藥、益生菌和發(fā)酵中藥均不同程度緩解了頭孢曲松鈉引起的變化，特別是發(fā)酵中藥顯示出更持久的緩解作用。研究結(jié)果為中藥、益生菌和發(fā)酵中藥在抗生素臨床使用上的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。