不同微生物發(fā)酵劑對(duì)核桃青皮的發(fā)酵效果研究

吳柳燕，付莉，付品，朱佳敏，趙玉雪，楊霞

（貴州省核桃研究所，貴州貴陽(yáng) 550002）

我國(guó)核桃栽培面積居世界首位，核桃青皮含有生物堿、鞣質(zhì)、多酚類、黃酮類、單寧類、香豆素、萜類、甾類和有機(jī)酸物質(zhì)等多種有機(jī)化合物，因此具有一定的植物源農(nóng)藥活性。堆置在野外的核桃青皮經(jīng)雨水漫泡后，浸出液流入江、河、湖泊中，河水變黑，魚、蝦全被毒死，對(duì)水體造成嚴(yán)重污染；而且核桃青皮中的纖維木質(zhì)素含量高，堿性較強(qiáng)，在自然界中降解速度慢，不易腐爛，堆置在田間則導(dǎo)致莊稼（甚至雜草）難以生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮質(zhì)地松軟，有機(jī)質(zhì)含量高，干青皮含纖維素約17%，木質(zhì)素約43%，還含有較高的K、Ca以及Fe、Mn、Zn、Mg、Cu等微量元素。

梁林波等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在核桃青皮堆肥過(guò)程中加入微生物發(fā)酵菌劑能使堆肥溫度升高，大大縮短堆肥時(shí)間，加快核桃青皮的堆肥腐熟。鑒于此，筆者研究微生物發(fā)酵劑對(duì)核桃青皮的發(fā)酵效果，以期挑選出對(duì)核桃青皮降解效果最好的微生物發(fā)酵劑，不僅能有效緩解核桃青皮還田帶來(lái)的環(huán)境污染，還能為核桃青皮制成生物有機(jī)肥奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

①微生物發(fā)酵劑：鄭州啟富農(nóng)業(yè)科技有限公司；②有機(jī)物料發(fā)酵劑：君德生物科技有限公司；③沃寶：河南沃寶生物科技有限公司；④青皮腐解物：撥開(kāi)堆積的青皮腐解物，5點(diǎn)法取內(nèi)部樣品，置于無(wú)菌袋中，4℃保存?zhèn)溆茫虎萆滞寥溃撼? cm表層土壤，取5～10 cm土壤樣品，置于無(wú)菌袋中，去掉草根、石子后過(guò)1 mm篩，4℃保存?zhèn)溆茫虎轈K：對(duì)照不加任何發(fā)酵劑。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1濾紙條崩解培養(yǎng)基。(NH4)2SO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、酵母粉0.1 g、濾紙條1 cm×6 cm 3條/瓶，pH 7.0，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.2.2核桃青皮降解率測(cè)定培養(yǎng)基。干燥的青皮粉末5 g、（NH4）2SO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.02 g，5 mmol/L pH=7的磷酸緩沖液15 mL，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.3 濾紙條崩解試驗(yàn)

稱取0.5 g不同的發(fā)酵樣品，加入50 mL濾紙條崩解培養(yǎng)基中，50℃靜止培養(yǎng)，記錄pH變化情況。濾紙剛分解斷裂時(shí)，轉(zhuǎn)接于同樣新鮮培養(yǎng)液中，如此分別轉(zhuǎn)接數(shù)代后，記錄崩解情況。

1.4 纖維素酶活性測(cè)定

分別取各發(fā)酵劑培養(yǎng)7 d的濾紙條（濾紙是聚合度中等的纖維素材料[2]，其活力代表了總纖維素酶活力）培養(yǎng)基上清液1 mL，按照以下步驟進(jìn)行纖維素酶活性測(cè)定。

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。無(wú)水葡萄糖80℃烘至恒重，制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，取6支試管分別加入標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，補(bǔ)加蒸餾水至2 mL，加入DNS試劑1.5 mL，沸水浴5 min，冷卻后定容至25 mL，分光光度計(jì)540 nm下測(cè)OD值。

1.4.2粗酶液制備。配制復(fù)篩培養(yǎng)基每瓶45 mL，接入5 mL種子懸液，置于28℃搖床中培養(yǎng)，3、7、11 d分別取1.5 mL于離心管中，10 000 r/min離心10 min得粗酶液。

1.4.3酶活性測(cè)定。取1 mL培養(yǎng)基上清液，10 000 r/min離心10 min得粗酶液。加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%CMC-Na溶液，在45℃下恒溫水解20 min，加入1.5 mL DNS顯色，沸水浴5 min，冷卻后定容至25 mL，分光光度計(jì)540 nm下測(cè)OD值（m1）。另外做對(duì)照，取上清1 mL，加入1 mL蒸餾水，在45℃下恒溫水解20 min，加入1.5 mL DNS顯色，沸水浴5 min，冷卻后定容至25 mL，分光光度計(jì)540 nm下測(cè)OD值（m2）。m1-m2=A，酶活力(μmol/mL)=A×1 000/2[3]。

1.5 不同發(fā)酵劑對(duì)核桃青皮的降解效果研究

使用三角瓶固體發(fā)酵的方法研究不同發(fā)酵劑對(duì)核桃青皮的降解效果。配好的核桃青皮降解率測(cè)定培養(yǎng)基分裝在6個(gè)250 mL三角瓶里，每瓶加入發(fā)酵劑0.1 g，以不加發(fā)酵劑為對(duì)照，混勻后置于50℃恒溫箱培養(yǎng)，10 d后測(cè)定其降解率。用無(wú)菌蒸餾水洗去可溶部分，過(guò)濾，將剩余物置于105℃烘箱中烘至恒重，用分析天平分別稱重記為M（g），降解率=（M-5）/5×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 濾紙條崩解試驗(yàn)pH變化及接代數(shù)情況

由表1可以看出，1號(hào)和3號(hào)的pH一直增大，而2號(hào)的pH先減小后增大，4號(hào)（青皮腐解物）和5號(hào)（森林土壤）的pH先增大后減小。

表1 濾紙條崩解試驗(yàn)pH變化情況

由表2可以看出，2號(hào)發(fā)酵劑對(duì)濾紙條崩解見(jiàn)效快，但是持續(xù)繁殖能力較弱，而1號(hào)發(fā)酵劑能夠轉(zhuǎn)接15代，持續(xù)98 d對(duì)濾紙條具有分解效果，說(shuō)明1號(hào)發(fā)酵劑對(duì)纖維素的降解效果較好。

表2 濾紙條崩解試驗(yàn)轉(zhuǎn)接代數(shù)情況

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

采用DNS還原法測(cè)定還原糖量[4]，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)擬合得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.521x+0.004 3（R2=0.994 3），其中y表示吸光度（A），x表示葡萄糖濃度（mg/mL）。

2.3 不同降解劑作用下的纖維素酶活性

由表3可知，1號(hào)發(fā)酵劑的酶活性較高，在11 d時(shí)達(dá)到67.0 U/mL，說(shuō)明其降解纖維素效果最好，而2號(hào)和3號(hào)發(fā)酵劑次之，4號(hào)和5號(hào)樣品對(duì)纖維素的降解效果較差。

表3 不同降解劑作用下的纖維素酶活性 U/mL

2.4 不同發(fā)酵劑對(duì)核桃青皮的降解率

由表4可知，1號(hào)發(fā)酵劑對(duì)核桃青皮的降解效果較好，在10 d時(shí)可以達(dá)到25.5%，而2號(hào)和3號(hào)降解效果次之，這與其對(duì)纖維素的降解效果一致。

表4 不同發(fā)酵劑對(duì)核桃青皮的降解效果

3 結(jié)論與討論

根據(jù)濾紙條崩解試驗(yàn)、纖維素酶活測(cè)定以及核桃青皮降解效果研究可知，1號(hào)微生物發(fā)酵劑（由地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌等組成）對(duì)核桃青皮的降解效果最好，可以作為核桃青皮降解處理的首選制劑。核桃青皮作為農(nóng)業(yè)廢棄物，如果隨意堆放，既污染環(huán)境，又造成浪費(fèi)，用發(fā)酵劑合理發(fā)酵后作為肥料回田，可以減少污染，使資源得以循環(huán)利用。該研究為核桃青皮的開(kāi)發(fā)利用提供了一定依據(jù)。