白菜黑腐病拮抗菌Lysobacter enzymogenesCX03的分離鑒定及生防效果研究

張子玉，謝學(xué)文，石延霞，柴阿麗，李 磊*，李寶聚*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2. 天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384)

白菜細(xì)菌性黑腐病是由野油菜黃單胞野油菜致病變種（Xanthomonas campestrispv.campestris）侵染引起的一種危害嚴(yán)重的細(xì)菌性病害[1]。具有寄主范圍廣、發(fā)病率高、防治難等特點(diǎn)[2,3]。目前，對(duì)該病害的防治主要依賴于化學(xué)藥劑，然而施用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境、生物體以及人類生活造成諸多負(fù)面影響。因此，利用有益微生物來(lái)防治白菜細(xì)菌性黑腐病具有廣闊的應(yīng)用前景。

溶桿菌Lysobacter廣泛分布于自然環(huán)境中，且對(duì)多種病原真菌、細(xì)菌、線蟲(chóng)具有溶菌活性等典型特征[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶溶桿菌L. enzymogenes、辣椒溶桿菌L. capsici、抗生素溶桿菌L. antibioticus對(duì)黃瓜猝倒病、羊茅草葉斑病、小麥赤霉病、大豆銹病和水稻白葉枯病等病害具有一定的防治效果[5-7]。產(chǎn)酶溶桿菌作為溶桿菌屬的模式種之一，國(guó)內(nèi)最早報(bào)道的生防溶桿菌菌株就是產(chǎn)酶溶桿菌 OH11，該菌株能有效拮抗水稻紋枯病菌、辣椒疫霉、瓜果腐霉病菌等多種植物病原真菌的生長(zhǎng)[8]，其主要作用物質(zhì)為次級(jí)代謝產(chǎn)物熱穩(wěn)定抗真菌因子（Heat-Stable Antifungal Factor，HSAF）。從黃瓜根際分離得到的產(chǎn)酶溶桿菌3.1T8能顯著拮抗黃瓜黃褐斑病菌和大豆疫霉的生長(zhǎng)[9]。產(chǎn)酶溶桿菌C3能夠有效防治由立枯絲核菌Rhizoctonia solani引起的高羊毛草褐斑病和禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum引起的小麥赤霉病等，該菌對(duì)多種線蟲(chóng)也具有很強(qiáng)的拮抗活性[10,11]。產(chǎn)酶溶桿菌N4-7可以有效防治夏季常發(fā)的草坪斑枯病[12]。辣椒溶桿菌NF87-2可以有效控制溫室中由立枯絲核菌R. solani引起的辣椒立枯病，其能夠抑制真菌菌絲體的生長(zhǎng)[13]。辣椒溶桿菌X2-3對(duì)小麥紋枯病、卵菌有較強(qiáng)的拮抗活性[14]。吳亞鵬和姬廣海等[6]發(fā)現(xiàn)抗生素溶桿菌 13-1對(duì)魔芋軟腐病有較好的控制效果，防效可達(dá)79.16%，能在魔芋根際高效定殖。從水稻根際分離的抗生素溶桿菌OH13對(duì)多種植物病原細(xì)菌展現(xiàn)較強(qiáng)的拮抗活性，可合成吩嗪類化合物等物質(zhì)來(lái)抑制植物病原細(xì)菌[15]。然而，關(guān)于產(chǎn)酶溶桿菌防治植物細(xì)菌病害的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究從白菜根際土壤中分離得到對(duì)白菜細(xì)菌性黑腐病有拮抗作用的生防細(xì)菌，篩選出拮抗菌株CX03。通過(guò)形態(tài)特征、生理生化測(cè)定、Biolog測(cè)定、酶活特性測(cè)定和多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定其分類地位。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)表明，菌株CX03對(duì)白菜黑腐病具有明顯的防治效果，防效可達(dá)90.4%，同時(shí)，菌株CX03還對(duì)其他4種植物病原細(xì)菌、4種植物病原真菌具有顯著的拮抗作用。本研究為白菜細(xì)菌性黑腐病的生物防治提供了理論支持，同時(shí)為該菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 野油菜黃單胞野油菜致病變種X. campestrispv.campestris、密執(zhí)安棒桿菌環(huán)腐致病變種Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus、丁香假單胞菌流淚致病變種Pseudomonas syringaepv.lachryrnans、密執(zhí)安棒桿菌密執(zhí)安致病變種C. michiganensissubsp.michiganensis、葡萄土壤桿菌Agrobacterium vitis、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、立枯絲核菌Rhizoctonia solani和灰葡萄孢菌Botrytis cinerea均具有較強(qiáng)的致病力，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所分離并保存。

1.1.2 供試試劑 細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒（DP302，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司），無(wú)水乙醇（分析純）純度≥99%，2×TaqMaster PCR Mix，ddH2O，瓊脂糖，TAE緩沖液，BM5000 DNA Marker。以上試劑均購(gòu)于北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、WA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基用于細(xì)菌抑菌譜的測(cè)定[16-20]，幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基用于幾丁質(zhì)酶測(cè)定[21]；CMC培養(yǎng)基用于纖維素酶的測(cè)定[18]，蛋白酶培養(yǎng)基用于蛋白酶測(cè)定[19]，生理生化特性測(cè)定所用培養(yǎng)基參見(jiàn)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[22]。

1.1.4 供試白菜品種 白菜“中白50”購(gòu)于中蔬種業(yè)科技北京有限公司。

1.2 拮抗菌株的分離及保存

山東省壽光市露地白菜根際土壤樣品，稱取每份土樣10 g，加入到90 mL滅菌水中，置于28 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)30 min。將混勻的土樣按照10-8～10-1進(jìn)行梯度稀釋，選用稀釋至梯度10-6、10-7、10-8的土樣進(jìn)行涂板，每個(gè)梯度吸取100 μL，涂布于LB培養(yǎng)基平板上，各涂3個(gè)平板，置于28 ℃培養(yǎng)2 d。挑取不同類型的菌落于LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化，純化3次后，保存于-80 ℃凍存管中。

1.3 拮抗菌株的篩選

1.3.1 供試菌株的培養(yǎng) 將-20 ℃保存的野油菜黃單胞野油菜致病變種菌株采用NA培養(yǎng)基平板上活化，28 ℃培養(yǎng)2 d，進(jìn)行生防菌篩選。

1.3.2 拮抗菌篩選 采用Stonie雙層培養(yǎng)法[20]，將拮抗菌株接種在液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至108cfu/mL。在90 mm PDA平板中心接種5 μL拮抗菌株的菌懸液，以接種液體LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照，28 ℃下培養(yǎng)24 h后在通風(fēng)櫥中向倒扣的培養(yǎng)皿中加入3 mL氯仿，靜置12 h。將野油菜黃單胞野油菜致病變種接種于NB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至108cfu/mL。在4 mL 5%（m/v）WA培養(yǎng)基中加入100 μL病原菌菌懸液，混勻后倒入PDA平板，作為上層。28 ℃培養(yǎng)48 h觀察并測(cè)量抑菌直徑。計(jì)算抑菌率，每個(gè)處理重復(fù)3次。抑菌率（%）＝抑菌直徑/對(duì)照菌落直徑×100。

1.4 拮抗菌株CX03的鑒定

1.4.1 菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及生理生化指標(biāo)測(cè)定 將菌株CX03在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，置于28 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察其菌落顏色和形態(tài)，同時(shí)參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[22]的方法，對(duì)菌株CX03進(jìn)行革蘭氏染色、生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、滑移運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、檸檬酸鹽的利用試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)。

1.4.2 Biolog檢測(cè) 挑取菌株CX03單菌落接種至 NA 培養(yǎng)基試管斜面上，28 ℃培養(yǎng)24 h。由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心使用 BIOLOG GENⅢ試劑盒（按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作）對(duì)菌株CX03進(jìn)行唯一碳源利用的測(cè)定。

1.4.3 菌株CX03多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌株CX03的基因組DNA后，利用細(xì)菌16S rDNA的通用引物和看家基因atpD、gyrB、rpoD的擴(kuò)增引物（表1），對(duì)菌株CX03的16S rDNA、atpD、gyrB、rpoD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR運(yùn)行程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得產(chǎn)物由博邁德生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。其余序列均下載于NCBI網(wǎng)站，用MEGA7.0、Sequence Matrix、Seaview4按順序連接、比對(duì)不同菌株的16S rDNA和atpD、gyrB、rpoD基因序列，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析其分類地位。

表1 用于擴(kuò)增4個(gè)看家基因的引物Table 1 Primers for amplifying four housekeeping genes

1.5 菌株CX03抑菌譜測(cè)定

采用雙層培養(yǎng)法對(duì)野油菜黃單胞野油菜致病變種X. campestrispv.campestris；密執(zhí)安棒桿菌環(huán)腐致病變種C. michiganensissubsp.sepedonicus；葡萄土壤桿菌A. vitis；密執(zhí)安棒桿菌番茄潰瘍病致病型C.michiganensissubsp.michiganensis；丁香假單胞菌流淚致病變種P. syringaepv.lachryrnans5種病原細(xì)菌進(jìn)行抑菌測(cè)定，具體操作步驟同1.3.2。

采用平板對(duì)峙法[24]對(duì)尖孢鐮刀菌F. oxysporum；疫霉菌P. capsici；立枯絲核菌R. solani；灰葡萄孢B. cinerea進(jìn)行抑菌譜測(cè)定。在PDA平板中央接種直徑5 mm所選取的真菌靶標(biāo)菌片，28 ℃下培養(yǎng)2 d；在距平板中央3.5 cm處接種5 mL菌株CX03濃度為108cfu/mL菌懸液。以液體LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)5 d。每個(gè)處理重復(fù)3次。測(cè)量靶標(biāo)菌的對(duì)照菌落直徑和處理菌落直徑，用抑菌率表示。抑菌率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100。

1.6 菌株CX03生長(zhǎng)速率及pH值測(cè)定

將菌株CX03接種在液體NB培養(yǎng)基中，28 ℃下振蕩培養(yǎng)16 h后，將菌懸液加入NB培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)OD600為0.8，共設(shè)置3個(gè)重復(fù)，放置28 ℃搖床培養(yǎng)。每隔4 h測(cè)1次，連續(xù)測(cè)量48 h，記錄每次測(cè)得菌落數(shù)及pH值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 菌株CX03酶活特性檢測(cè)

1.7.1 蛋白酶檢測(cè) 在蛋白酶培養(yǎng)基中心位置接種5 μL OD600為0.8的菌株CX03的菌懸液，每個(gè)處理重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察消解圈。

1.7.2 纖維素酶檢測(cè) 在CMC培養(yǎng)基中心位置接種5 μL OD600為0.8的菌株CX03的菌懸液，28 ℃培養(yǎng)24 h后，3 mL剛果紅染料染色30 min，5 mL 1 mol/L NaCl溶液脫色15 min，每個(gè)處理重復(fù)3次，觀察消解圈。

1.7.3 幾丁質(zhì)酶測(cè)定 在幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基中心位置接種5 μL OD600為0.8的菌株CX03的菌懸液，每個(gè)處理重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)3 d后，觀察消解圈。

1.8 菌株CX03盆栽防效試驗(yàn)

采用噴霧接種法[25]進(jìn)行防效測(cè)定，將黑腐病原菌接種在液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃下振蕩培養(yǎng) 24 h，調(diào)整菌懸液1×108cfu/mL，選取大小基本一致的白菜幼苗，均勻噴施黑腐病原菌菌懸液，處理24 h后，均勻噴施生防細(xì)菌菌懸液，共設(shè)置3個(gè)處理：（1）菌株CX03菌懸液100倍液（1×108cfu/mL）；（2）3%春雷霉素1000倍液；（3）清水對(duì)照。每個(gè)處理8株苗，其后每天觀察白菜發(fā)病情況。計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)與防治效果。白菜細(xì)菌性黑腐病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[26]為：0級(jí)，無(wú)?。?級(jí)，每葉有病斑1～5個(gè)；3級(jí)，每葉有病斑6～10個(gè)；5級(jí)，每葉有病斑 11～15個(gè)；7級(jí)，每葉有病斑 16～20 個(gè)；9級(jí)，每葉有病斑 21個(gè)以上。發(fā)病率（%）＝100×發(fā)病總?cè)~數(shù)/調(diào)查總?cè)~數(shù)，病情指數(shù)＝100×∑（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9），防治效果（%）＝100×（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用GraphPad Prism 8軟件繪圖，采用 IBM SPSS Statistics 20 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜細(xì)菌性黑腐病拮抗細(xì)菌的分離與抑菌效果

從白菜根際土壤中分離得到 8株細(xì)菌，采用 Stonie雙層培養(yǎng)法篩選以野油菜黃單胞野油菜致病變種X. campestrispv.campestris為指示菌有拮抗作用的生防菌，其中4株生防菌抑制率在20%以上。菌株CX03的抑菌效果最好（圖1），抑菌直徑達(dá)3.10 cm，抑菌率達(dá)到34.40%（表2）。因此，選取菌株CX03作為野油菜黃單胞野油菜致病變種拮抗菌。

圖1 菌株CX03對(duì)白菜黑腐病的抑制效果Fig. 1 The inhibitory effect of strain CX03 on black rot of Chinese cabbage

表 2 8株生防細(xì)菌對(duì)白菜黑腐病的抑制效果Table 2 Inhibition effect of eight strains of biocontrol bacteria on black rot of Chinese cabbage

2.2 白菜細(xì)菌性黑腐病拮抗菌株CX03的鑒定

2.2.1 菌株CX03生理生化指標(biāo)測(cè)定 菌株CX03在NA培養(yǎng)基，菌落形態(tài)都呈淡黃色，菌落表面突出，菌體濕潤(rùn)有光澤，粘液狀，不易挑起。同時(shí)結(jié)合菌株CX03生理生化測(cè)定，菌株CX03為革蘭氏陰性菌，28 ℃～37 ℃，NaCl含量1%可以生長(zhǎng)，具有滑移性。接觸酶、檸檬酸鹽利用、明膠液化反應(yīng)為陽(yáng)性，淀粉水解、V-P反應(yīng)為陰性。Biolog檢測(cè)結(jié)果表明，菌株CX03可以利用D-麥芽糖、D-海藻糖、D-松二糖和α-D-乳糖，不能利用葡聚糖、水蘇糖、龍膽二糖和D-蜜三糖（表3）。通過(guò)透射電鏡觀察可以看到菌株CX03菌體均無(wú)鞭毛，菌體為桿狀（圖2）；通過(guò)掃描電鏡觀察到菌株表面有褶皺。初步鑒定菌株CX03為溶桿菌屬細(xì)菌。

圖2 菌株CX03的形態(tài)觀察Fig. 2 Morphological phenotype of strain CX03

圖 3 菌株CX03基于多基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of based on the multigene sequences of strain CX03

表3 菌株CX03生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characters of strain CX03

2.2.2 16S rDNA基因擴(kuò)增及序列分析 基于PCR擴(kuò)增獲得菌株CX03的16S rDNA和3個(gè)管家基因gyrB、atpD、rpoD序列，用MAGA7.0軟件，采用最大似然法構(gòu)建菌株CX03多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析顯示菌株CX03與產(chǎn)酶溶桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株L. enzymogenesATCC 29487T聚在一簇，同源性達(dá)到100%（圖3）。與已報(bào)道的產(chǎn)酶溶桿菌L. enzymogenesOH11的同源性達(dá)到97%。綜上所述，通過(guò)確定菌株CX03的培養(yǎng)形態(tài)、生理生化特性及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定菌株CX03為產(chǎn)酶溶桿菌。

2.3 菌株CX03抑菌譜測(cè)定

菌株CX03對(duì)5種病原細(xì)菌均具有較好的抑菌效果，其中對(duì)黃單胞菌抑菌率最高達(dá)到35.40%，顯著高于其他4株病原菌；對(duì)4種病原真菌也具有一定抑菌效果，對(duì)灰葡萄孢菌抑菌率可達(dá)24.92%，說(shuō)明菌株CX03具有廣譜拮抗作用（表4、圖4）。

圖4 菌株CX03對(duì)5種病原菌的抑制作用Fig. 4 Inhibition effect of strain CX03 on 5 kinds of pathogenic bacteria

表4 菌株CX03對(duì)九種病原菌的抑制效果Table 4 The inhibitory effect of CX03 on 9 different pathogenic bacteria

2.4 菌株CX03生長(zhǎng)特性及酶活特性檢測(cè)

生長(zhǎng)特性測(cè)定結(jié)果表明，菌株CX03在0～20 h時(shí)處于指數(shù)增長(zhǎng)期，20 h時(shí)菌落數(shù)達(dá)到2.01×1011cfu/mL，34 h后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)入穩(wěn)定增長(zhǎng)期。pH值隨著時(shí)間逐漸增加，在48 h時(shí)pH值達(dá)到8.15（圖5）。

圖5 菌株CX03生長(zhǎng)曲線及pH值測(cè)定Fig. 5 Bacterial biomass and pH during the growth of strain CX03

酶活特性檢測(cè)結(jié)果表明，菌株CX03在CMC培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)染色、脫色，形成黃色透明圈，在蛋白酶培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基中都有非常明顯的的透明圈產(chǎn)生。因此，推測(cè)菌株CX03代謝產(chǎn)物中包含纖維素酶、蛋白酶和幾丁質(zhì)酶（圖6）。

圖6 菌株CX03酶活性測(cè)定Fig. 6 Enzyme activity of strain CX03

2.5 菌株CX03防治白菜細(xì)菌性黑腐病防效測(cè)定

在溫室條件下，檢測(cè)菌株CX03對(duì)白菜細(xì)菌性黑腐病的防治效果結(jié)果表明，菌株CX03處理組的病情指數(shù)為8.40，顯著低于春雷霉素處理組的病情指數(shù)14.40，及對(duì)照試驗(yàn)組的病情指數(shù)90.60。菌株CX03對(duì)白菜黑腐病的防效達(dá)90.70%，也顯著高于春雷霉素的防效84.10%（表5，圖7）。

表5 菌株CX03對(duì)白菜黑腐病的盆栽防效Table 5 Control efficiency of strain CX03 on black rot of Chinese cabbage

圖7 菌株CX03對(duì)白菜黑腐病盆栽防效Fig. 7 Control efficiency of strain CX03 on black rot of Chinese cabbage

3 討論

本試驗(yàn)從山東省壽光市露地白菜根際土壤分離獲得一株對(duì)白菜細(xì)菌性黑腐病具有良好拮抗作用的生防細(xì)菌CX03。根據(jù)掃描電鏡觀察到菌株CX03呈桿狀、菌體無(wú)鞭毛；生理生化特性中革蘭氏染色陰性，V-P反應(yīng)陰性，具有滑移運(yùn)動(dòng)能力；通過(guò)多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，菌株與產(chǎn)酶溶桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29487T以及其他已報(bào)道的產(chǎn)酶溶桿菌菌株（OH11、C3、M497-1、YC36等）聚在一簇，在形態(tài)特征上及生理生化特性上符合產(chǎn)酶溶桿菌的描述[27]。綜合多種鑒定結(jié)果，菌株CX03鑒定為產(chǎn)酶溶桿菌L. enzymogenes。

溶桿菌屬細(xì)菌對(duì)多種病原微生物包括真菌、細(xì)菌、卵菌和線蟲(chóng)等都具有較高的拮抗活性[28]，目前在生防報(bào)道中產(chǎn)酶溶桿菌研究報(bào)道較多，產(chǎn)酶溶桿菌OH11是以產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物熱穩(wěn)定抗真菌因子HSAF對(duì)真菌及卵菌產(chǎn)生拮抗作用，HSAF通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺酶的合成途徑來(lái)改變菌絲的形態(tài)，從而達(dá)到控制病害的目的[29]。辣椒溶桿菌AZ78產(chǎn)生2,5-二酮哌嗪對(duì)馬鈴薯晚疫病菌和霜霉病菌具有較高的拮抗活性[7]。抗生素溶桿菌OH13產(chǎn)生一種具有廣譜抗細(xì)菌活性的物質(zhì)myxin[30]。Wei等[31]通過(guò)采用高效液相色譜、質(zhì)譜等技術(shù)從抗生素溶桿菌13-1發(fā)酵液中成功分離出6-甲氧基-10氧基-1-吩嗪醇、吩嗪、吩嗪-1-羧酸及1-羥基-6-甲氧基吩嗪四種吩嗪類化合物，對(duì)水稻白葉枯病原菌有強(qiáng)烈的抑菌活性。Harad等[32]從溶桿菌 8294發(fā)酵液中分離得到對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有拮抗抑菌作用的次生代謝產(chǎn)物WAP-8294A2。Hashizume等[33]從溶桿菌屬細(xì)菌發(fā)酵液中分離出縮氨酸類抗生素tripropeptins A、B、C、D和Z，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有較強(qiáng)的抑菌作用。本研究中，產(chǎn)酶溶桿菌CX03對(duì)5種病原細(xì)菌和4種病原真菌均具有明顯的抑制效果?；诰闏X03全基因組序列信息和antiSMASH分析，預(yù)測(cè)菌株CX03可合成菌黃素（xanthomonadin I）、溶桿菌素（lysobactin）、吩嗪類物質(zhì)（Le-pyrrolopyrazines）等11種次生代謝產(chǎn)物，但菌株CX03次生代謝物中不含有熱穩(wěn)定抗真菌因子（HSAF）。此外，菌株CX03還包含特有的次生代謝物thailanstatin A、lankacidin C（數(shù)據(jù)未發(fā)表），推測(cè)其抑制植物病原細(xì)菌活性可能與其特有的次級(jí)代謝產(chǎn)物有關(guān)，但具體是哪類物質(zhì)、或者其中一種或幾種物質(zhì)協(xié)同作用，還需進(jìn)一步探究。酶活特性測(cè)定表明，菌株CX03可以分泌纖維素酶、蛋白酶和幾丁質(zhì)酶，推測(cè)其抑菌作用與其分泌的胞外水解酶也相關(guān)。

本研究報(bào)道了一株產(chǎn)酶溶桿菌CX03對(duì)白菜黑腐病菌有顯著抑菌活性，該菌可以分泌多種胞外水解酶并預(yù)測(cè)可合成多種次生代謝產(chǎn)物，具有較廣的抑菌譜。溫室盆栽試驗(yàn)證明，菌株CX03對(duì)白菜黑腐病的防治效果達(dá)90.7%。這些結(jié)果說(shuō)明菌株CX03在植物病害生物防治研究中具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。下一步研究將圍繞菌株CX03抑菌機(jī)理和發(fā)酵工藝進(jìn)行深入研究，為后續(xù)揭示該菌株的生防機(jī)制和生防產(chǎn)品研發(fā)及應(yīng)用提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。