濕法凈化磷酸與熱法磷酸在微生物發(fā)酵應(yīng)用中的差異研究

李文飛，王鳳霞,2，楊 坤

(1 中低品位磷礦及共伴生資源高效利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550016；2 甕福(集團(tuán))有限責(zé)任公司，貴州 貴陽 550000；3 黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，貴州 凱里 556012)

腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosinetriphosphate)簡稱三磷酸腺苷(ATP)，是由1分子腺嘌呤，1分子核糖和3分子磷酸基團(tuán)組成的一種不穩(wěn)定的高能磷酸化合物，也是生物體內(nèi)最直接的能量來源，從而保證了細(xì)胞各項(xiàng)生命活動的能量供應(yīng)。對于動物、人、真菌和大多數(shù)細(xì)菌來說，合成ATP的主要途徑都是來自于細(xì)胞自身進(jìn)行的呼吸作用釋放的能量。ATP中的P既是代表的磷酸基團(tuán)。由此可知，磷在生命體中起到重要作用。在微生物培養(yǎng)基中添加適量的磷，可促進(jìn)菌體健康快速的生長繁殖，提高微生物代謝產(chǎn)物的合成量[1-4]。微生物培養(yǎng)基制備過程中一般添加磷酸鹽以滿足微生物繁殖及生長。但在工業(yè)化生產(chǎn)過程中需考慮成本、添加方式等問題，由此微生物發(fā)酵廠家多采用磷酸代替磷酸鹽產(chǎn)品。國內(nèi)市售磷酸產(chǎn)品目前有熱法磷酸和濕法凈化磷酸兩種。熱法磷酸的生產(chǎn)工藝能耗較大、成本相對較高，且容易產(chǎn)生對人體有害的毒性氣體，在國際上已被濕法凈化磷酸產(chǎn)品所替代。國內(nèi)的磷酸市場有80%以上都被濕法凈化磷酸所占據(jù)，但仍有部分企業(yè)由于某方面原因，還在生產(chǎn)并使用熱法磷酸[5]?！禛B2760-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中，對食品工業(yè)用加工助劑使用中明確規(guī)定指出，磷酸可作為食品工業(yè)用加工助劑(發(fā)酵用營養(yǎng)物質(zhì))在發(fā)酵工藝上使用[6]，因此本文特將濕法凈化磷酸與熱法磷酸同時作為發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)在微生物發(fā)酵工藝中進(jìn)行試驗(yàn)，以驗(yàn)證兩者是否存在差異。本試驗(yàn)選取了真菌菌株(釀酒酵母菌SaccharomycescerevisiaeHansen)、與細(xì)菌菌株(枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis)進(jìn)行相關(guān)微生物發(fā)酵試驗(yàn)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料及試劑

試驗(yàn)菌種：真菌(釀酒酵母菌)、細(xì)菌(枯草芽孢桿菌)，貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌種保存室提供。

磷酸：食品添加劑磷酸(濕法)(85%)，甕福(集團(tuán))有限責(zé)任公司；食品添加劑磷酸(熱法)(85%)，市售。

試劑：磷酸二氫鉀、葡萄糖、瓊脂、硫酸銨、氧化鈣、氫氧化鈉、碘粒、碘化鉀等，以上試劑均為分析純。

培養(yǎng)基及試劑配制：

培養(yǎng)基參照參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行配制。

真菌培養(yǎng)基：YPD基礎(chǔ)培養(yǎng)基、YPD磷酸鹽培養(yǎng)基(在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀10 g)、YPD磷酸培養(yǎng)基(在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加與磷酸二氫鉀同等磷含量的磷酸)。

細(xì)菌培養(yǎng)基：LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基、LB磷酸鹽培養(yǎng)基(在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀0.35 g)、LB 磷酸培養(yǎng)基(在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀同等磷含量的磷酸)。

淀粉培養(yǎng)基：配制方法參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行配制。

固體培養(yǎng)基配制：按照以上配方，每1000 mL培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂即可。

1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、DNS顯色液：配制方法參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行配制。

盧哥氏碘液：碘粒1 g，碘化鉀2 g。先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘粒溶解在碘化鉀中，待碘完全溶解后加純水定容至300 mL。

1.2 主要儀器和設(shè)備

DB-XAB型石墨加熱板，力辰科技；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅；TDL-5-A高速離心機(jī)，上海安亭；DHP-9052B型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒；VD-650型超凈工作臺(帶紫外燈)，力辰科技；PL-180型偏光顯微鏡，德國蔡司；PE Lambda型紫外可見分光光度計(jì)，美國熱電等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 真菌菌株(釀酒酵母)發(fā)酵試驗(yàn)

采用固體發(fā)酵、液體發(fā)酵兩種方式進(jìn)行試驗(yàn)。固體發(fā)酵檢測指標(biāo)：菌株單菌落直徑；液體發(fā)酵檢測指標(biāo)：真菌生長量、菌絲體干重、發(fā)酵能力、產(chǎn)酒精量等。

1.3.2 細(xì)菌菌株(枯草芽孢桿菌)發(fā)酵試驗(yàn)

采用固體發(fā)酵、液體發(fā)酵兩種方式進(jìn)行試驗(yàn)。固體發(fā)酵檢測指標(biāo)：菌株單菌落直徑、產(chǎn)淀粉酶能力；液體發(fā)酵檢測指標(biāo)：細(xì)菌生長曲線、細(xì)菌生長量等。

1.3.3 檢測方法

單菌落直徑：用接種針挑取單一菌落點(diǎn)于平皿中間，待生長72小時后(枯草芽孢桿菌生長48小時)，用游標(biāo)卡尺測量單菌落直徑大小。

生長曲線：參照微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程(第四版)[7]采用比濁法測定生長曲線進(jìn)行測定?？莶菅挎邨U菌生長曲線測定參照文獻(xiàn)[8-9]測定。

發(fā)酵液中生長量、菌絲干重測定、發(fā)酵能力(二氧化碳產(chǎn)生量)參照文獻(xiàn)[10-12]檢測方法進(jìn)行測定。

發(fā)酵液殘?zhí)橇繀⒄瘴墨I(xiàn)[13]檢測方法進(jìn)行測定。

產(chǎn)酒精量(氣相色譜法)、發(fā)酵液總酸、氨基酸態(tài)氮含量參照GB/T13662-2008標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定[14]。

產(chǎn)淀粉酶能力測定參照文獻(xiàn)[15]測定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS17.0軟件中進(jìn)行分析，多重比較(LSD)確定組間差異，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，并以O(shè)rigin軟件作圖， EXCEL軟件作表。表中標(biāo)相同字母無差異(P>0.05)，不同字母代表有差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌菌株(釀酒酵母)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 單菌落測定

圖1 酵母菌單菌落

由圖1可看出，在添加熱法磷酸(3#)、濕法凈化磷酸(4#)的固體培養(yǎng)基上，酵母單菌落直徑要比基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1#)和添加磷酸鹽的培養(yǎng)基(2#)大。

2.1.2 生長曲線繪制

由圖2釀酒酵母生長曲線可以看出，培養(yǎng)基中添加磷酸鹽(磷酸二氫鉀)、熱法磷酸及濕法凈化磷酸均能促進(jìn)酵母菌的生長，能夠促使酵母菌提前進(jìn)入生長對數(shù)期，且在穩(wěn)定期持續(xù)時間與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比有所延長，這對微生物的次級代謝發(fā)酵具有重要意義。

圖2 釀酒酵母生長曲線

2.1.3 生長量測定

真菌類生長狀況可根據(jù)發(fā)酵液中細(xì)胞含量以及菌絲體干重兩個指標(biāo)進(jìn)行判斷，由此將酵母菌進(jìn)行了72 h液體發(fā)酵。結(jié)果見表1。

表1 真菌菌株液體發(fā)酵

2.1.4 發(fā)酵能力(二氧化碳產(chǎn)生量)

酵母發(fā)酵72 h后稱量發(fā)酵液的重量，因每瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)體積相同，因此測單位時間內(nèi)發(fā)酵液失重量為CO2的產(chǎn)生量即可反應(yīng)發(fā)酵能力。

表2 真菌菌株(酵母菌)產(chǎn)CO2量

由表2可知培養(yǎng)基中添加適量磷酸及磷酸鹽與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比能夠產(chǎn)生更多的CO2，且熱法磷酸與濕法磷酸培養(yǎng)基的CO2產(chǎn)生量略有差異但不顯著。

2.1.5 發(fā)酵液殘?zhí)橇繙y定

(1)吸收光譜的測定

將葡萄糖與DNS試劑反應(yīng)液在波長190～750 nm進(jìn)行掃描，可知在500 nm處具有最大吸收峰，因此選擇λmax=500 nm進(jìn)行檢測。

圖3 葡萄糖與 DNS試劑反應(yīng)液的紫外一可見吸收光譜

(2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

(3)發(fā)酵液中殘?zhí)橇繙y定

表3 酵母菌發(fā)酵液殘?zhí)橇?/p>

由表3可知培養(yǎng)基中添加適量熱法磷酸或濕法磷酸，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比消耗了較多的糖分，且存在顯著性差異，而濕法磷酸和熱法磷酸試驗(yàn)組差異不明顯，進(jìn)一步說明熱法磷酸與濕法磷酸在酵母發(fā)酵過程中不存在顯著差異。

2.1.6 產(chǎn)酒精量測定結(jié)果

表4 真菌菌株(酵母菌)發(fā)酵液酒精度

表4可知3#熱法磷酸培養(yǎng)基與4#濕法凈化磷酸培養(yǎng)基發(fā)酵后的酒精度分別為4.47、4.49，在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上沒有顯著性差異，說明培養(yǎng)基中添加濕法磷酸與熱法磷酸的發(fā)酵效果一致。

2.1.7 總酸、氨基酸態(tài)氮含量測定

表5 真菌菌株(酵母菌)發(fā)酵液總酸、氨基酸態(tài)氮含量

由表5可以看出液體培養(yǎng)基中添加濕法磷酸PPA與熱法磷酸TPA均能提高發(fā)酵液中總酸和氨基酸態(tài)氮含量，且提高量無顯著差異。

2.2 細(xì)菌菌株(枯草芽孢桿菌)發(fā)酵試驗(yàn)

2.2.1 單菌落測定

圖5 枯草芽孢桿菌單菌落

通過對單菌落直徑檢測，基礎(chǔ)培養(yǎng)基、磷酸鹽培養(yǎng)基、熱法磷酸培養(yǎng)基和濕法凈化磷酸培養(yǎng)基中單菌落直徑分別為7.579、10.021、11.051、11.363 mm；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，磷酸鹽培養(yǎng)基、熱法磷酸培養(yǎng)基和濕法凈化磷酸培養(yǎng)基均與基礎(chǔ)培養(yǎng)基存在顯著性差異。

2.2.2 生長曲線繪制

圖6 枯草芽孢桿菌生長曲線

由圖6枯草芽孢桿菌生長曲線可以看出，培養(yǎng)基中添加磷酸鹽、熱法磷酸及濕法磷酸均能促進(jìn)枯草芽孢桿菌生長量的增加，能夠促使菌株提前進(jìn)入生長對數(shù)期，且在穩(wěn)定期持續(xù)時間與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比有所延長。

圖7 枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶能力測試

由圖7可知，從四種培養(yǎng)基上挑取的枯草芽孢桿菌在產(chǎn)淀粉酶能力上均未收到影響。從透明圈直徑/單菌落直徑數(shù)值來看，產(chǎn)酶能力相當(dāng)，不存在顯著差異。

2.2.3 發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果與分析

表6 枯草芽孢桿菌發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

由表6可知，枯草芽孢桿菌在1#培養(yǎng)基與2#、3#、4#中的生長量、單菌落直徑上存在一定差異，說明培養(yǎng)基中添加適量熱法磷酸和濕法凈化磷酸對枯草芽孢生長具有一定促進(jìn)作用；在產(chǎn)淀粉酶透明圈直徑、產(chǎn)淀粉酶菌落直徑、產(chǎn)淀粉酶透明圈直徑/菌落直徑值上不存在顯著性差異，由此說明說明培養(yǎng)基中添加適量熱法磷酸和濕法磷酸對枯草芽孢產(chǎn)淀粉酶能力不會產(chǎn)生抑制。

3 結(jié) 論

微生物培養(yǎng)基中加入磷酸鹽、熱法磷酸和濕法凈化磷酸對真菌菌株釀酒酵母和細(xì)菌菌株枯草芽孢桿菌發(fā)酵，并菌株單菌落直徑、生長量、發(fā)酵能力、產(chǎn)酒精量、總酸量、產(chǎn)淀粉酶能力等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出磷酸鹽、熱法磷酸與濕法凈化磷酸在以上指標(biāo)上并無顯著性差異，從使用效果來看，在微生物發(fā)酵應(yīng)用過程中三者不存在顯著性差異，進(jìn)一步可說明濕法凈化磷酸和熱法磷酸與磷酸鹽一樣能夠做為微生物發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)用。