橡膠樹紅根病病原菌LAMP檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

賀春萍 董文敏 吳偉懷 梁艷瓊 李銳 謝立 黃興 易克賢

摘? 要：由靈芝菌（Ganoderma pseudoferreum）引起的紅根病是橡膠上危害面積最廣、影響最大的世界性根部傳染性病害。本研究利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），以G. pseudoferreum線粒體Large rDNA特異片段為靶標(biāo)序列，設(shè)計(jì)出G. pseudoferreum 特異性LAMP引物，以SYBR Green I為指示劑，建立基于顏色判斷的直觀、快速、靈敏的G. pseudoferreum LAMP檢測(cè)方法，優(yōu)化了反應(yīng)體系和條件，進(jìn)行了特異性、靈敏度及田間疑似病樣的檢測(cè)驗(yàn)證。結(jié)果表明：整個(gè)試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間僅需80 min，在等溫64 ℃條件下反應(yīng)1 h能特異性檢測(cè)出G. pseudoferreum;特異性檢測(cè)中，G. pseudoferreum菌株擴(kuò)增后呈陽(yáng)性（綠色），而其他真菌均為陰性（橙色）。該技術(shù)最低檢測(cè)限為110?5 ng/μL。田間疑似病樣LAMP體系檢測(cè)，病原檢出率為85%。本研究建立的LAMP檢測(cè)技術(shù)為橡膠樹紅根病菌的快速鑒定提供了新技術(shù)。

關(guān)鍵詞：靈芝菌;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增;分子檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S794.1;S763.7? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Rubber tree red root disease caused by Ganoderma pseudoferreum is proved to be a serious disease， which is the most widespread and harmful to rubber tree （Hevea brasiliensis） production. This study reports the development of a loop-mediated isothernal amplification （LAMP） assay targeting the mitochondria large rDNA for visual detection of G. pseudoferreum. The mitochondria large rDNA-LAMP assay efficiently amplified the target gene within 80 min at 64 ℃ （in 1 hour） and was evaluated for specificity and sensitivity. A positive color or （green） was only observed in the presence of G. pseudoferreum by SYBR Green I as an indicator reaction after amplification; however none of other pathogens changed color （still orange）. The lower limit of detection of the LAMP assay was about 110?5 ng/μL of genomic DNA， which was 1000 times more sensitive than the PCR method. Twenty strains of suspected samples in the field were tested by the LAMP system with the pathogen detection rate was 85%. This method would provide a new technology for the rapid identification of G. pseudoferreum.

Keywords： Ganoderma pseudoferreum; loop-mediated isothermal amplification; molecular detection

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.025

天然橡膠是全球重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資，是國(guó)防工業(yè)和高端裝備生產(chǎn)中不可替代的重要原料[1]。橡膠樹根病是由植物病原真菌侵染橡膠樹根部引起，常造成根頸部腐爛，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株死亡。由橡膠靈芝菌（Ganoderma pseudo ferreum）侵染引起的紅根病是天然橡膠生產(chǎn)中危害面積最廣、影響最大的世界性根部傳染性病害，主要分布在東南亞從印度尼西亞到巴布亞新幾內(nèi)亞和新卡里多尼亞、馬來(lái)西亞、菲律賓、科特迪瓦等熱帶地區(qū)。在中國(guó)所有種植橡膠的地區(qū)普遍發(fā)生紅根病，發(fā)病嚴(yán)重林段發(fā)病率達(dá)40%，若未及時(shí)防治，死亡率可達(dá)100%[2]。紅根病菌的寄主非常廣泛，除危害橡膠樹外，還侵染刀把木、厚皮樹、三角楓、苦楝樹、臺(tái)灣相思、山枇杷、柑橘、可可、咖啡、荔枝、茶樹、雞血藤等多種植物[3]。紅根病病菌生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)學(xué)鑒定困難。當(dāng)植株地上部表現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，紅根病菌可能已傳染至其他鄰近膠樹，常錯(cuò)過(guò)最佳防治時(shí)機(jī)。因此建立一種快速鑒定橡膠樹紅根病菌的早期檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于生產(chǎn)上指導(dǎo)該病害防治和減少病害損失具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

目前對(duì)橡膠樹紅根病菌的檢測(cè)以病癥識(shí)別和組織分離病原菌及形態(tài)鑒定為主，但傳統(tǒng)方法耗時(shí)長(zhǎng)、專業(yè)性強(qiáng)、靈敏度低，難以達(dá)到快速鑒別的目的。利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)該病病原菌的方法有普通PCR法[4-6]，雖然能夠較準(zhǔn)確檢測(cè)出病原菌，但需要PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)等高價(jià)的專業(yè)儀器設(shè)備和分子生物學(xué)專業(yè)的實(shí)驗(yàn)操作人員，不適宜在田間以及基層大規(guī)模應(yīng)用，使病情無(wú)法及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)及有效防控。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）是近年發(fā)展起來(lái)的應(yīng)用微生物快速檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)[7]。該技術(shù)可在恒溫條件下，利用高活性的鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）對(duì)目的DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增[8]，60～65 ℃恒溫反應(yīng)30～60 min便能達(dá)到109～1010個(gè)拷貝數(shù)量級(jí)。該技術(shù)不用進(jìn)行變性、退火、延伸等一系列溫度變化，無(wú)需特殊高端的儀器設(shè)備，恒溫水浴鍋即可滿足實(shí)驗(yàn)需求，具有快速、簡(jiǎn)便、高效、靈敏、經(jīng)濟(jì)等特征。目前該技術(shù)已在植保等諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9-10]，極大地提高了鑒定效率和準(zhǔn)確率。建立可視化、快速、靈敏、便捷的橡膠樹紅根病菌LAMP檢測(cè)技術(shù)可為橡膠樹紅根病的發(fā)生和防治提供重要的技術(shù)手段。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株? 橡膠樹紅根病菌（G. pseudoferreum）菌株GP011、GP014、GP021、GP043，橡膠樹褐根病菌（Phellinus noxius）菌株P(guān)n008、Pn012、Pn020，橡膠樹紫根病菌（Helicobasidium compactum）菌株HC001，橡膠樹白根病菌（Rigidoporus lignosus）菌株RL004，橡膠樹臭根病菌（Sphaerostilbe repens）菌株Sr001，橡膠樹炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌株RC178，柱花草炭疽病菌（C. gloeosporioides）菌株CH008，芒果炭疽病菌（C. gloeosporioides）菌株MT1，橡膠樹白粉病菌（Oidium heveae Steinm）菌株BF1和劍麻斑馬紋病菌（Phytophora nicotianae）菌株BM1，均為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶特色經(jīng)濟(jì)作物病害研究組分離、鑒定和保藏。

1.1.2? 供試試劑? 氨芐青霉素（Amp）、E. coli trans T1、pEASY-T1 Cloning vector、10 mmol/L? dNTPs購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;Plasmid Mini Kit I、Fungal DNA Kit、Gel extraction Kit均購(gòu)于美國(guó)Omega公司;DL2000 Maker、10×rTaq Buffer、2.5 mmol/L dNTPs、rTaq DNA Polymerase均購(gòu)自TaKaRa公司;甜菜堿Betaine（B8230）、SYBR Green I核酸染料、Golden View I核酸染色劑購(gòu)自Solarbio公司;瓊脂糖（Agarose）購(gòu)自西班牙Biowest公司。NEB 3.0 Bst-DNA Polymerase、10×Bst-DNA Polymerase Buffer、100 mmol/L MgSO4均購(gòu)自北京NEB生物技術(shù)有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 病原菌培養(yǎng)及核酸提取? 將供試菌株的菌絲塊分別轉(zhuǎn)至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）中，置于28 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)7～10 d后過(guò)濾，收集菌絲，冷凍干燥，提取總DNA。病原菌總DNA的提取參照試劑盒（Fungal DNA Kit）說(shuō)明書進(jìn)行。所提取的DNA保存在?20 ℃冰箱中備用。

1.2.2? 引物設(shè)計(jì)與合成? 參照文獻(xiàn)[11]提供的通用線粒體Larage rDNA引物對(duì)提取的橡膠樹紅根病病菌橡膠靈芝菌（G. pseudoferreum）進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。通過(guò)大量比對(duì)GenBank中下載不同種和屬的同源性G. pseudoferreum的線粒體Larage rDNA基因的核酸序列，找到多態(tài)性豐富區(qū)段（特異序列）并應(yīng)用在線軟件Primer Explorer V4（http：// primerexplorer.jp/e/）設(shè)計(jì)用于LAMP的外引物F3和B3，內(nèi)引物FIP和BIP（表1）。設(shè)計(jì)的引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。引物用ddH2O溶解后分裝保存于?20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化? 參考吳家林等[12]的方法并略作改動(dòng)，對(duì)LAMP反應(yīng)體系中的各反應(yīng)組分濃度進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)引物配比進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)定內(nèi)外引物配比比例分別為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1;dNTPs終濃度分別為0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol/L;Mg2+終濃度分別為2、3、4、6、8 mmol/L;甜菜堿終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mol/L;反應(yīng)溫度分別設(shè)為57、58、59、60、61、63、64、65 ℃;反應(yīng)時(shí)間分別為15、30、45、60、75、90 min。每個(gè)因子設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以確定最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，加入1 μL SYBR Green I進(jìn)行熒光染色，觀察反應(yīng)管顏色變化，若反應(yīng)管呈現(xiàn)亮綠色則反應(yīng)呈陽(yáng)性，若為橙色，則反應(yīng)為陰性[13]。將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如凝膠電泳圖為瀑布狀梯形條帶即為陽(yáng)性，反之則為陰性。

1.2.4? LAMP檢測(cè)的特異性? 利用1.2.3中優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)1.1.1中所述供試菌株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性。反應(yīng)產(chǎn)物分別經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳和SYBR Green I染色觀察。

1.2.5? LAMP檢測(cè)的靈敏度? 通過(guò)超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000c）將橡膠樹紅根病菌菌株GP021基因組DNA初始濃度調(diào)整為100 ng/?L，并將其依次稀釋為101、100、10?1、10?2、10?3、10?4、10?5、10?6、10?7 ng/μL 10個(gè)不同濃度梯度。每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，將3個(gè)重復(fù)混合，取1 μL不同濃度的模板用于LAMP反應(yīng)，無(wú)菌水作為空白對(duì)照。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，并通過(guò)SYBR Green I顯色驗(yàn)證。

為了比較LAMP和普通PCR間的靈敏度，使用LAMP外引物F3和B3（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA初始濃度與LAMP靈敏度檢測(cè)設(shè)置的濃度一致。PCR反應(yīng)體系：10 mmol/L dNTPs 2 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，2.5 μmol/L引物F3/B3各1 μL，Ex Taq酶0.5 μL（2.5 U），模板1 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

1.2.6? 田間樣本檢測(cè)? 選用來(lái)自海南儋州、白沙等地樣本共20份（表2）。樣本有褐色壞死的莖基部、根組織，有病根表皮變棗紅色或黑紅色木質(zhì)部，或木質(zhì)部變海綿狀濕腐，皮木間有白色至深黃色腐竹狀菌膜，有半圓形或不規(guī)則形灰褐色、紅褐色或黑褐色子實(shí)體。采用普通PCR法、基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）方法對(duì)20份樣品進(jìn)行分析診斷。對(duì)發(fā)病的莖基部、根組織及子實(shí)體，取病/健交界處剪碎，將剪碎的樣品利用天根植物組織基因組DNA試劑盒提取病部組織DNA。以橡膠樹健康植株基因組DNA為對(duì)照，進(jìn)行普通PCR和LAMP擴(kuò)增。普通PCR擴(kuò)增使用引物F3/B3，反應(yīng)體系與方法如1.2.5所述;LAMP使用引物F3/B3和FIP/BIP，反應(yīng)體系與方法如1.2.3所述。

2? 結(jié)果與分析

2.1? LAMP檢測(cè)體系的優(yōu)化

2.1.1? 反應(yīng)體系優(yōu)化? 通過(guò)對(duì)LAMP反應(yīng)體系中各組分濃度的優(yōu)化，確定用于檢測(cè)橡膠樹紅根病菌的LAMP最佳反應(yīng)體系為：F3和B3各為0.2 μmol/L，F(xiàn)IP和BIP各為1.2 μmol/L，dNTPs為1.4 mmol/L，Mg2+為4 mmol/L，甜菜堿為0.8 mol/L，Bst-DNA Polymerase為8 U/μL，模板DNA為1 μL，10×Bst-DNA Polymerase Buffer?2.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足25 μL。

2.1.2? 反應(yīng)條件優(yōu)化? 采用上述最佳反應(yīng)體系進(jìn)行最適反應(yīng)溫度的篩選，結(jié)果表明，在57、58、59、60、61、63、64、65 ℃ 8個(gè)不同的反應(yīng)溫度下均有擴(kuò)增，且產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后均可見(jiàn)梯狀條帶，當(dāng)加入熒光染色劑SYBR Green I后反應(yīng)液均由橙色變?yōu)榫G色，但在64 ℃溫度條件下，反應(yīng)擴(kuò)增效率高，顏色變化明顯，故確定LAMP反應(yīng)溫度為64 ℃（圖1A，圖1B）。

如圖2A、圖2B所示，在所設(shè)置的6個(gè)反應(yīng)時(shí)間下，15 min時(shí)不能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，在反應(yīng)30、45 min時(shí)，條帶較為暗淡，在60、75、90 min時(shí)均可以很好地?cái)U(kuò)增。在反應(yīng)60 min時(shí)，條帶較為清晰且加入染色液后產(chǎn)物顏色變化明顯，故確定LAMP反應(yīng)時(shí)間為60 min。

2.2? LAMP特異性檢測(cè)

用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系對(duì)橡膠樹紅根病菌以及擔(dān)子菌的其他屬、其他真菌等15個(gè)菌株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以ddH2O作為陰性對(duì)照以驗(yàn)證引物的特異性。凝膠電泳結(jié)果表明，4株橡膠樹紅根病菌菌株DNA擴(kuò)增產(chǎn)物均出現(xiàn)梯狀條帶，而其余11個(gè)陰性菌株及空白對(duì)照均未出現(xiàn)任何條帶（圖3A）。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)管中加入SYBR Green I染料后，其中橡膠樹紅根病菌反應(yīng)管呈現(xiàn)綠色，為陽(yáng)性反應(yīng)，而其他對(duì)照病原菌及空白對(duì)照反應(yīng)管中反應(yīng)液均保持橙色（圖3B）。表明本LAMP引物對(duì)橡膠樹紅根病菌的檢測(cè)具有很好的特異性。

2.3? LAMP檢測(cè)的靈敏度

以菌株GP021的DNA濃度稀釋梯度（1× 102～1×10?7）ng/μL為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，凝膠電泳檢測(cè)表明：當(dāng)模板濃度為1× 10?5 ng/μL時(shí)，可見(jiàn)明顯的梯狀條帶（圖4A）;加入SYBR Green I染料后顯色結(jié)果表明，當(dāng)模板濃度為1×10?5 ng/μL時(shí)，反應(yīng)液顏色由橙色變?yōu)榫G色（圖4B），與凝膠電泳結(jié)果一致。說(shuō)明LAMP檢測(cè)的最低檢測(cè)限度為1×10?5 ng/μL，即10 fg/μL。

以菌株GP021的DNA濃度稀釋梯度（1× 102～1×10?7）ng/μL為模板，以LAMP外引物F3和B3進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明：模板DNA含量為（1×102～110?2）ng/uL時(shí)均能檢測(cè)到明顯的目的條帶，為陽(yáng)性反應(yīng)（圖4C）;而110?2 ng/uL濃度下的DNA表現(xiàn)為陰性擴(kuò)增。由此表明PCR檢測(cè)的最低檢測(cè)濃度為10 pg/uL。從圖4對(duì)比中可以得出LAMP檢測(cè)的靈敏度是普通PCR的1000倍。

2.4? 田間樣本檢測(cè)

對(duì)田間采集的20份樣本分別利用普通PCR法和LAMP法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，用所建立的LAMP方法進(jìn)行擴(kuò)增，有17份樣本呈現(xiàn)明顯的擴(kuò)增片段，表明17份樣本中有G. pseudoferreum，檢出率為85%（表2）;利用LAMP特異性外引物的普通PCR進(jìn)行檢測(cè)，檢出15份陽(yáng)性，檢出率75%（表2）。普通PCR法檢測(cè)效率低于LAMP法。綜上所述，LAMP法特異性強(qiáng)、靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，適合于田間或基層樣品的快速檢測(cè)。

3? 討論

LAMP是一種可以在恒溫條件下，高效、特異、快速的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)具特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短（1.5 h）、無(wú)需高價(jià)儀器設(shè)備、檢測(cè)結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)，在植保等諸多領(lǐng)域有廣泛報(bào)道。國(guó)外學(xué)者最初通過(guò)LAMP檢測(cè)番茄花葉病毒病[14]。Shan等[15]利用LAMP于玉米秸稈內(nèi)快速檢測(cè)出鐮刀菌，從而防止鐮刀菌產(chǎn)生的毒素進(jìn)入食物鏈。陸辰晨[13]建立的LAMP技術(shù)可以檢測(cè)大豆根腐病等多種不同病原菌。王賢達(dá)等[16]利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)柑橘黃龍病病原菌，檢測(cè)靈敏度達(dá)10?6 ng/uL，是普通PCR的1000倍，為柑橘黃龍病早期診斷提供了快速檢測(cè)的方法[16]。橡膠樹紅根病病菌生長(zhǎng)極為緩慢，分離培養(yǎng)階段易受其他微生物污染，分離成功率低;且不易產(chǎn)孢，病原鑒定困難。因此，相對(duì)于傳統(tǒng)病原真菌分離來(lái)說(shuō)，建立高效、靈敏、快速、簡(jiǎn)便的病原早期分子檢測(cè)技術(shù)在病害防治中尤為重要。

LAMP檢測(cè)方法的建立中，靶標(biāo)基因篩選和引物設(shè)計(jì)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素。本研究最初利用G. pseudoferreum ITS、tef-1α、β-tublin基因設(shè)計(jì)引物均未能得到多態(tài)性豐富區(qū)域（特異區(qū)間），后利用rDNA基因通用引物[11]進(jìn)行序列擴(kuò)增獲得G. pseudoferreum的多態(tài)性豐富區(qū)域，設(shè)計(jì)了5組LAMP引物反復(fù)篩選，結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的引物其特異性滿足實(shí)驗(yàn)要求。內(nèi)、外引物濃度比是影響LAMP成功擴(kuò)增的重要因素之一，外引物濃度過(guò)低，將導(dǎo)致反應(yīng)不完全，濃度過(guò)高將抑制內(nèi)引物的起始擴(kuò)增。外引物濃度一般是內(nèi)引物濃度的1/4～ 1/10[12]。本研究通過(guò)優(yōu)化確定適宜的內(nèi)、外引物濃度比為6∶1，確定了G. pseudoferreum最優(yōu)LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，結(jié)合SYBR Green I的顯色，建立了橡膠樹紅根病菌的可視化LAMP檢測(cè)方法。

本文首次報(bào)道了應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測(cè)G. pseudoferreum，相對(duì)于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，該方法具有特異性高（識(shí)別靶序列6個(gè)獨(dú)立區(qū)域）、檢測(cè)成本低（64 ℃恒溫水浴鍋完成，無(wú)需PCR等高價(jià)儀器）、反應(yīng)時(shí)間短（擴(kuò)增反應(yīng)僅需1 h）、靈敏度高（最低檢測(cè)限10 fg/μL）和結(jié)果判定簡(jiǎn)便（反應(yīng)液加入SYBR Green I可視化）等優(yōu)勢(shì);而普通PCR雖能較準(zhǔn)確檢測(cè)出病原菌，但耗時(shí)長(zhǎng)，需要PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等高價(jià)儀器和專業(yè)操作人員;傳統(tǒng)的組織分離、病菌形態(tài)鑒定的方法耗時(shí)長(zhǎng)、專業(yè)性強(qiáng)、靈敏度低，難以達(dá)到快速鑒定的目的。LAMP技術(shù)相比于傳統(tǒng)組織分離培養(yǎng)的繁瑣費(fèi)時(shí)以及PCR儀器的檢測(cè)高成本，其優(yōu)勢(shì)突顯，適用于田間、基層樣品的初篩和快速檢測(cè)。本研究中通過(guò)對(duì)20份田間疑似病樣進(jìn)行分離、檢測(cè)，其中利用LAMP檢測(cè)出17份樣品呈陽(yáng)性，普通PCR檢測(cè)出15份呈陽(yáng)性，而病樣組織分離培養(yǎng)僅4份樣品分離出G. pseudoferreum。由于G. pseudoferreum分離培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)、分離成功率低、鑒定專業(yè)性強(qiáng)，因此所建立的快速、靈敏、準(zhǔn)確、高效、結(jié)果可視化的LAMP檢測(cè)技術(shù)對(duì)G. pseudoferreum早期分子檢測(cè)具有較大的優(yōu)勢(shì)，對(duì)及時(shí)、科學(xué)、有效防治橡膠樹紅根病和減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn)

王立豐， 陳月異， 田維敏. 巴西橡膠樹光合作用研究與展望[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2011， 32（1）： 176-181.

白建相， 王? 涓， 黃? 林， 等. 云南河口墾區(qū)橡膠樹根病普查及治理方法探討[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技， 2008， 31（4）： 7-11.

李增平， 羅大全. 橡膠樹病蟲害診斷圖譜[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2007： 59-64.

彭? 軍， 張? 賀， 張? 欣， 等. 橡膠樹紅根病病原菌rDNA- ITS序列鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（7）： 1393-1397.

Wang X C， Xi R J， Li Y， et al. The species identity of the widely cultivated Ganoderma， ‘G. lucidum （Ling-zhi）， in China[J]. PLoS One， 2012， 7（7）： e40857.

Cao Y， Wu S H， Dai Y C. Specids clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom ‘Lingzhi[J]. Fungal Diversity， 2012， 56（1）： 49-62.

Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research， 2000， 28（12）： 63.

Dai T T， Lu C C， Lu J， et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Phytophthora sojae[J]. FEMS Microbiology Letters， 2012， 334（1）： 27-34.

Qin W T， Wang Z Y， Zhang H. Application of loop-mediated isothermal amplification in detecting plant pathogens[J]. Journal of Agricultural Science and Technology， 2013， 15（3）： 169-174.

彭丹丹， 張?jiān)疵鳎?舒燦偉， 等. 植物病原真菌分子檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2017， 36（5）： 2015-2022.

White T J， Bruns T， Lee S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//Innis M A， Gelfand D H， Sninsky J J， et al. PCR Protocols： A guide to methods and applications. Academic Press， San Diego， 1990： 315-322.

吳家林， 沙? 丹， 馬廣源， 等. 沙門氏菌LAMP檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)病原生物學(xué)雜志， 2015， 10（7）： 611-614.

陸辰晨. 基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速診斷大豆根部主要病害的研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.

Shiro F， Shinro K， Keiko Y， et al. Detection of tomato yellow leaf curl virus by loop-mediated isothermal amplification reaction[J]. Journal of Virological Methods， 2003， 112（1/2）： 35-40.

Shan L， Abdul H H， Zhang J， et al. A loop-mediated isothermal amplification （LAMP） assay for the rapid detection of toxigenic Fusarium temperatum in maize stalks and kernels[J]. Intetnational Journal of Food Microbiology， 2019， 291： 72-78.

王賢達(dá)， 林雄杰， 胡菡青， 等. 柑橘黃龍病可視化LAMP檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（5）： 918-924.

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