芒果MiFRI1和MiFRI2基因的克隆與表達(dá)分析

黃方 羅聰 余海霞 范志毅 謝小杰 劉源 莫嘯 何新華

摘? 要：FRIGIDA（FRI）是植物春化途徑中影響成花的關(guān)鍵基因之一。本研究克隆了2個芒果FRI基因，分別命名為MiFRI1和MiFRI2。序列生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，MiFRI1和MiFRI2基因的ORF長度分別為1752、1815 bp，編碼584、605個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為64.98、66.86 kDa。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，MiFRI1和MiFRI2分別屬于FRIGIDA和FRIGIDA-like兩個分支。表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，MiFRI1和MiFRI2基因在芒果的葉、莖和芽（花）中均表達(dá)。MiFRI1在芒果的營養(yǎng)期和成花轉(zhuǎn)變期之間的各個組織中表達(dá)水平均較低，而在花芽分化后期的葉片和芽中表達(dá)水平顯著升高且達(dá)到頂峰。MiFRI2的表達(dá)高峰在不同組織中出現(xiàn)的時間不同。2個MiFRIs基因在營養(yǎng)芽轉(zhuǎn)向花芽發(fā)育的過程中的頂芽中表達(dá)水平均下降，但在花芽分化后期的頂芽中表達(dá)水平又再次上升，而在葉片中2個基因的表達(dá)高峰均出現(xiàn)在花芽分化后期，但MiFRI1的表達(dá)水平高于MiFRI2。說明MiFRIs與芒果的花發(fā)育有關(guān)，但2個基因發(fā)揮功能的程度可能存在差異。

關(guān)鍵詞：芒果;FRIGIDA;克隆;生物信息學(xué);表達(dá)模式

中圖分類號：S813.3? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： FRIGIDA （FRI） is one of the key genes which influence flower formation in plant in response to vernalization pathway. In this study， two FRI genes named MiFRI1 and MiFRI2 were cloned in mango. Sequence analysis showed that the open reading frame of MiFRI1 and MiFRI2 genes was 1752 bp and 1815 bp in length， encoding 584 and 605 amino acids with molecular weight 64.98 kDa and 66.86 kDa， respectively. Phylogenetic tree analysis showed that MiFRI1 and MiFRI2 belonged to FRIGIDA and FRIGIDA-like family， respectively. Expression analysis showed that MiFRI1 and MiFRI2 expressed in leaves， stems and buds/flowers. The expression level of MiFRI1 was low in all tested tissues between vegetative stage and flowering transition stage， while MiFRI1 increased transcriptional level to the peak in leaves and buds at the later stage of bud differentiation. The expression peak of MiFRI2 varied among different tissues. The expression level of both MiFRIs genes decreased in the terminal bud during the vegetative bud transition to flower bud， but increased again in the bud at the later stage of flower bud differentiation. The peak of MiFRIs both occurred in leaves at the late stage of flower bud differentiation， but the transcriptional level of MiFRI1 was higher than that of MiFRI2. It indicates that MiFRIs may play important roles to the flower development in mango.

Keywords： mango; FRIGIDA; cloning; bioinformatics; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.003

開花是植物由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變過程，是植物個體發(fā)育和繁殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，適時開花對植物的繁殖成功至關(guān)重要[1]，故關(guān)于開花的課題屬于熱點(diǎn)研究。與草本植物相比，木本果樹通常具有較長的童期，嚴(yán)重制約木本果樹新品種的選育，直接影響經(jīng)濟(jì)效益。因此，對木本果樹成花分子機(jī)制開展研究具有重要的意義[2]。

植物成花過程受內(nèi)部遺傳因子和外界環(huán)境因素的協(xié)同誘導(dǎo)[3]，涉及復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑主要包括：光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、自主途徑、溫敏途徑和年齡途徑[4-5]。許多植物需要一段時間的低溫春化作用才能開花[6]，F(xiàn)RIGIDA（FRI）和FLOWERING LOCUS C（FLC）是擬南芥春化途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因，F(xiàn)RI通過促進(jìn)FLC的表達(dá)延遲植物的開花時間[7]。自然條件下擬南芥開花時間的多樣性可歸因于FRI顯性基因的等位變異，冬性生態(tài)型擬南芥通常具有FRI顯性基因，能促進(jìn)開花抑制基因FLC的高表達(dá)，造成晚花表型[8]，而喪失功能（即顯性基因等位突變）的FRI使FLC表達(dá)量降低，則出現(xiàn)早花表型[9]。Risk等[10]發(fā)現(xiàn)擬南芥中至少有7個FRI同源基因構(gòu)成FRIGIDA基因家族。目前對FRI基因的研究主要集中在模式植物擬南芥和一些依賴春化作用來促進(jìn)成花的植物上，木本植物也只在雷竹[11]、枳[12]和銀杏[13]中有報道。

芒果（Mangifera indica L.）是漆樹科芒果屬的多年生木本植物，是重要的熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)果樹。芒果實(shí)生苗需要經(jīng)歷較長的童期才能開花結(jié)果，嚴(yán)重制約了芒果新品種的選育進(jìn)程。目前在芒果成花研究中已有一些成花基因的研究報道[14]，但還尚未有FRI基因的報道。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以‘四季蜜芒為材料，對通過RT-PCR法獲得的2個MiFRI基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時熒光定量PCR分析這2個基因在不同組織不同時期的表達(dá)模式，為深入研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究以‘四季蜜芒（Mangifera indica L cv. ‘Sijimi）為供試材料，栽培于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)科研基地果樹標(biāo)本園。基因克隆樣品葉片采集于2018年11月5日;組織器官和不同發(fā)育時期樣本分別采集于2018年11月5日、2018年12月5日、2019年1月4日、2019年1月29日的葉、莖、芽以及2019年3月6日的葉、莖、花。樣品采集后立即放入?80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 方法

1.2.1? 總RNA的提取及cDNA合成? 使用RNA perp Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA的完整性和濃度。采用寶生物工程（大連）有限公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA第一鏈合成，反應(yīng)體系與程序參照試劑盒說明書進(jìn)行，瓊脂糖凝膠電泳檢測逆轉(zhuǎn)錄效果。逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA用于后續(xù)基因克隆和表達(dá)模式分析。

1.2.2? 芒果MiFRI1和MiFRI2基因的克隆? 根據(jù)前期芒果轉(zhuǎn)錄組獲得的2個FRI基因全長序列，設(shè)計擴(kuò)增基因編碼區(qū)的特異引物FRI1-F/R和FRI2-F/R（表1），以‘四季蜜芒葉片的cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10 mmol/L dNTPs 0.5 ?L、10×PCR buffer 2.5 ?L、10 ?mol的上下游引物各1 ?L、Trans Taq 0.15 ?L、cDNA模板1 ?L、補(bǔ)超純水至25 ?L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，連接到pMD18-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3? 生物信息學(xué)分析? 運(yùn)用BioXM 2.6軟件對獲得的基因核苷酸序列進(jìn)行氨基酸序列推測;用在線軟件ExPASy-ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam/）分析蛋白分子質(zhì)量;利用Conserved Domain Search（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測蛋白的保守結(jié)構(gòu)域;在NCBI下載FRI氨基酸同源序列，使用DNAMAN 5.2.2軟件進(jìn)行序列比對和同源性分析，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4? 芒果MiFRI1和MiFRI2基因表達(dá)特性分析? 以芒果MiActin1為內(nèi)參基因[15]，根據(jù)基因序列設(shè)計熒光定量引物（表1），分別提取芒果不同部位的總RNA，采用寶生物工程（大連）有限公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，實(shí)時熒光定量PCR所用儀器為ABI 7500 Real Time PCR儀（Applied Biosystems，美國加利福尼亞），反應(yīng)體系和程序參照SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ試劑（TaKaRa，中國大連）說明書。具體如下：以50 ?g/L的cDNA為模板，反應(yīng)體系（20 ?L）：SYBRⅡ 10 ?L，ROXⅡ 0.4 ?L，cDNA 2 ?L，上下游引物各0.5 ?L，超純水6.6 ?L。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán);循環(huán)結(jié)束后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s進(jìn)行熔解。每個樣品重復(fù)3次，采用2?CT法[16]計算基因的相對表達(dá)量。使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.01），用Excel 2016繪制表達(dá)圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 芒果MiFRIs基因的克隆與序列分析

在前期芒果轉(zhuǎn)錄組研究中獲得2個FRI同源基因，分別命名為MiFRI1和MiFRI2。為了驗(yàn)證基因序列的正確性，以‘四季蜜芒葉片cDNA為模板，用特異性引物FRI1F/R和FRI2F/R對其編碼區(qū)全長序列進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測分別得到長度約1700～1800 bp大小的特異條帶（圖1），克隆測序獲得序列與轉(zhuǎn)錄組獲得序列一致。MiFRI1基因（GenBank登錄號：MT239367）編碼區(qū)序列長度為1752 bp，MiFRI2基因（GenBank登錄號：MT239368）編碼區(qū)序列長度為1815 bp，分別編碼584、605個氨基酸（圖2），蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為64.98、66.86 kDa。

2.2? 芒果MiFRIs同源性及進(jìn)化樹分析

通過NCBI-Conserved Domain Search預(yù)測到2個MiFRIs都含有Frigida結(jié)構(gòu)域，屬于FRIGIDA基因家族（圖3）。經(jīng)同源性分析結(jié)果顯示，MiFRI1?和MiFRI2基因的核苷酸和氨基酸同源性分別為39.89%和19.22%，同源性較低。芒果MiFRI1與柑橘CcFRI（XP_006437019.2）、甜橙CsFRI（XP_006485045.1）、龍眼DlFRI（AIN75611.1）編碼氨基酸的同源性分別為56.65%、56.65%和53.23%，MiFRI2與阿月渾子PvFRL 1（XP_ 031253371.1）同源性為74.00%。使用DNAMAN 5.2.2將2個MiFRIs的氨基酸序列與上述物種氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示，F(xiàn)RI氨基酸序列整體保守性較低，但MiFRI1、CsFRI、CcFRI和DlFRI之間保守性較高，MiFRI2與PvFRL1彼此間也很保守（圖4），說明同一類型基因在不同物種間具有保守性，推測MiFRI1和MiFRI2可能屬于不同類型的FRI家族。

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載不同物種FRIGIDA和FRIGIDA-like（FRL）的氨基酸序列，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖5。整個進(jìn)化樹被分為五類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，芒果MiFRI1與擬南芥AtFRI、阿月渾子PvFRI、榴蓮DzFRI、可可TcFRI聚在Ⅰ類，而芒果MiFRI2與擬南芥AtFRL1/2、阿月渾子PvFRL、榴蓮DzFRL1/2、可可TcFRL1/2聚在Ⅱ類，說明MiFRI1和MiFRI2屬于FRIGIDA家族不同類型的亞族，MiFRI1屬于Ⅰ類亞族，MiFRI2屬于Ⅱ類亞族。

2.3? 芒果MiFRIs基因的組織表達(dá)特性分析

為了探討MiFRIs基因在芒果成花過程中的表達(dá)特性，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測MiFRI1和MiFRI2在‘四季蜜芒不同花發(fā)育階段不同組織中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，MiFRI1和MiFRI2在不同時期內(nèi)的各組織中均表達(dá)，但在各個組織中表達(dá)水平存在差異（圖6）。

MiFRI1基因從營養(yǎng)期到花芽分化前期之間的各個組織中表達(dá)水平均偏低，而從花芽分化期開始，其表達(dá)水平在葉片和芽中迅速上升。MiFRI1基因的表達(dá)最高峰出現(xiàn)花芽分化后期的葉中，而此時MiFRI1基因在頂芽中也達(dá)到表達(dá)高峰，而在花序伸長及開花期的葉片和花中的表達(dá)水平則有所下降，但依然極顯著高于營養(yǎng)時期相應(yīng)的組織，但在莖中的表達(dá)一直維持在較低的水平。MiFRI2基因在不同組織中的表達(dá)模式存在差異。在葉片中，MiFRI2基因表達(dá)水平先下降后上升，表達(dá)高峰出現(xiàn)在花芽分化后期，而后稍微有些下降，這與MiFRI1基因在葉片中的表達(dá)模式類似。在莖中，MiFRI2基因呈現(xiàn)先上升再下降的表達(dá)模式，這與MiFRI1基因相反。在頂芽中，MiFRI2基因的表達(dá)水平為先下降后上升，從營養(yǎng)期到花芽分化前期之間的表達(dá)模式與MiFRI1基因類似，在花芽分化后期MiFRI2基因表達(dá)水平上升，但上升幅度低于MiFRI1基因。

3? 討論

FRI基因是植物響應(yīng)春化途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)能促進(jìn)下游開花抑制基因FLC的表達(dá)，從而抑制植物的成花轉(zhuǎn)變[17]。FLC表達(dá)高則抑制開花激活因子FT和SOC1基因的表達(dá)，表現(xiàn)為晚花，反之則表現(xiàn)為早花[18]。最新研究發(fā)現(xiàn)FRI在春化過程中是通過與某些蛋白相互作用形成復(fù)合物參與到FLC染色質(zhì)上組蛋白甲基化修飾來調(diào)控植物成花[19-20]。因此FRI在植物開花調(diào)控過程中具有重要作用。

目前FRI基因已在大豆[21]、紫花苜蓿[22]、咖啡樹[23]、雷竹[11]、枳[12]等物種中被分離克隆，但尚未見有芒果FRI基因的研究報道。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，從芒果轉(zhuǎn)錄組中挖掘獲得2個FRI基因，通過RT-PCR技術(shù)對其序列的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，MiFRI1和MiFRI2的編碼區(qū)序列長度分別為1752、1815 bp，分別編碼584、605個氨基酸，編碼蛋白含有Frigida結(jié)構(gòu)域，屬于FRIGIDA基因家族。但2個FRI基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均很低，進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，MiFRI1與AtFRI聚類在一起，屬于Ⅰ類亞族，而MiFRI2與AtFRL1/2聚類在一起，屬于Ⅱ類亞族，表明二者由不同祖先進(jìn)化而來。

FRIGIDA家族成員基因在被子植物和裸子植物中廣泛存在，Risk等[10]將擬南芥FRIGIDA家族的7個同源蛋白依據(jù)其N-端序列保守性分為FRI （Ⅰ）、FRL1/2 （Ⅱ）、FRL3 （Ⅲ）、FRL4a/4b （IV）和FRL5 （V）五類亞族，認(rèn)為Ⅰ、Ⅱ類亞族僅在雙子葉植物存在，Ⅲ、Ⅳ類亞族同時存在于單子葉植物和雙子葉植物中，Ⅴ亞族只在擬南芥和毛果楊中發(fā)現(xiàn)。另外，Michelle等[24]研究證實(shí)擬南芥中的AtFRI和AtFRL1均為成花抑制因子，能夠促進(jìn)成花抑制基因FLC的表達(dá)，在AtFRI缺失時，AtFRL1具有冗余的功能。而AtFRL2存在于Landsberg erecta（Ler）型擬南芥中，屬于無功能基因[25]，其他亞族的功能還未見報道。

根據(jù)目前已經(jīng)報道的一些物種的功能研究顯示，枳中的PtFRI基因?qū)儆冖駚喿?，主要在葉和花中表達(dá)較高，異源表達(dá)抑制擬南芥開花[12]。雷竹是單子葉植物，PvFRL基因?qū)儆冖髞喿?，在營養(yǎng)組織和生殖器官中均有表達(dá)，但在花期表達(dá)水平明顯下降，超量表達(dá)抑制擬南芥成花[11]?？Х菴aFRL4基因是Ⅳ亞族，主要在葉片中表達(dá)[23]。而銀杏屬于裸子植物，GbFRI基因在雄花中高度表達(dá)，而在葉中表達(dá)水平最低[13]。在其他植物中，擬南芥中的AtFRI基因在各個組織中的表達(dá)水平均很低，主要在發(fā)育中的種子中表達(dá)，而AtFRL2基因在各個組織中表達(dá)水平也很低，但在發(fā)育中的種子和花粉中具有較高的表達(dá)水平[10]。油菜BnaA.FRI.a基因在葉和莖中少量表達(dá)，而在花芽和花中高表達(dá)[26]。油菜中的BnaA3.FRI基因在種子中表達(dá)水平最高，其次在根、葉、芽中表達(dá)，在莖中最低[27]。白菜中的BrFRIa和BrFRIb基因的表達(dá)水平與成花時間早晚不相關(guān)，但超量表達(dá)的BrFRIb可延遲轉(zhuǎn)基因擬南芥成花[28]。上述研究結(jié)果表明，不同物種中的FRI基因的表達(dá)模式存在差異，但功能相對保守，均抑制轉(zhuǎn)基因植株成花。本研究中，MiFRI1和MiFRI2在‘四季蜜芒成花過程中不同時期內(nèi)的各組織中均有表達(dá)，其中MiFRI1基因主要在花芽分化后期的葉和芽/花中高度表達(dá);MiFRI2基因主要在營養(yǎng)期的頂芽和花芽分化后期的葉片中高度表達(dá)。這與雷竹中的PvFRI-L基因花期表達(dá)水平下降的模式存在差異。2個MiFRIs基因在營養(yǎng)芽轉(zhuǎn)向花芽發(fā)育的過程中的頂芽中表達(dá)水平下降，但在花芽分化后期的芽中表達(dá)水平又再次上升，且MiFRI1基因的上升水平顯著高于MiFRI2基因。說明MiFRIs基因與芒果的成花有關(guān)，但2個基因發(fā)揮的功能強(qiáng)弱可能存在差異，有待進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：黃東杰