子宮內(nèi)膜癌中Mortalin蛋白的表達(dá)及臨床意義*

尹香琳，王馨悅，韓安娜，李楠，楊洋

（1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉133002；2. 溫州大學(xué)，浙江 溫州325035）

子宮內(nèi)膜癌（Endometrial carcinoma, EC）是最常見的女性生殖系統(tǒng)侵襲性腫瘤之一[1]，50～59 歲為其發(fā)病高峰期。在美國，EC 的新發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第4 位，占每年新發(fā)癌癥的7%，死亡患者高達(dá)10 170 例[2]。在中國，EC 新發(fā)病率不斷上升，僅次于宮頸癌[3]，每年新發(fā)患者約為5 萬例，死亡人數(shù)為1.8 萬[4]，且患者呈現(xiàn)明顯的年輕化趨勢。由于部分早期EC 患者對傳統(tǒng)手術(shù)治療方法較為抵觸，且中晚期EC 患者生存期短，治療效果差，預(yù)后欠佳，因此發(fā)現(xiàn)新型生物標(biāo)志物對EC 早期診斷、靶向治療及預(yù)后評估有著重要的臨床意義。

壽命蛋白（Mortalin/HSPA9/GRP75/mtHSP70/HSPA9B）是一種葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，約75 kD，屬于熱休克蛋白70 家族，是高度保守的線粒體分子伴侶蛋白[5]。其在核編碼蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白完整性的保持、細(xì)胞周期調(diào)控和線粒體產(chǎn)能等方面有至關(guān)重要的作用[6]。研究表明，Mortalin 蛋白在正常組織中無表達(dá)或低表達(dá)，但在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，如肝癌、胰腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等[6-9]。但關(guān)于Mortalin 蛋白在EC 組織中的表達(dá)尚未見報道。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測Mortalin 蛋白在88 例EC 組織和37 例正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，探討其與EC 臨床病理特征的關(guān)系，并分析Mortalin 蛋白表達(dá)在EC 患者臨床預(yù)后評估中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

收集2011年5月—2014年12月上海芯超科技有限公司組織芯片和吉林大學(xué)第二醫(yī)院的EC 組織標(biāo)本，包括88例EC組織和37例正常子宮內(nèi)膜組織。88 例EC 標(biāo)本中，年齡＜50 歲20 例，≥50 歲68 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63 例；病理分級：I 級25 例，Ⅱ級48 例，Ⅲ級15 例；國際TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ期60 例，Ⅲ+Ⅳ期28 例。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，蘇木精染液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，Mortalin抗體（ab53098）購自美國Abcam公司。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)EnVision 法檢測Mortalin 蛋白的表達(dá)[10]：4 μm 厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，抗原修復(fù)，滴加一抗Mortalin 抗體（稀釋比1∶200），4℃孵育過夜；次日滴加二抗，DAB 顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封固。為證明Mortalin 蛋白抗體免疫組織化學(xué)檢測的特異性，選用Mortalin 蛋白強(qiáng)陽性染色的切片，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗的染色結(jié)果作為陰性對照。根據(jù)Beesly 分級法，以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色顆粒為Mortalin 蛋白陽性染色的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行判斷，細(xì)胞質(zhì)中無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)的比例判斷：陽性細(xì)胞數(shù)0%～5%為0 分，＞5%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分。將兩項得分結(jié)果相乘：0 分為（-），1～4 分 為（+），5～8分為（++），9～12 分為（+++）。以總分≤4分為低表達(dá)，總分＞4分為高表達(dá)。

1.3 生存分析

應(yīng)用UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）分析Mortalin mRNA 在EC組織中的表達(dá)水平，采用The Human Protein Atlas （https：//www.proteinatlas.org/） 和The Cancer Genome Atlas（TCGA）（http：//kmplot. com/analysis/index. php? p=service＆start=1）數(shù)據(jù)庫分析Mortalin 蛋白表達(dá)與EC患者預(yù)后的關(guān)系，并根據(jù)基因和蛋白的相對表達(dá)量將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，統(tǒng)計和分析EC 患者的預(yù)后情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%） 表示，比較采用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較采用Log-rank χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mortalin蛋白在EC組織中高表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，Mortalin 蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織中低表達(dá)或不表達(dá)，在EC 組織中高表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)（見圖1）。Mortalin 蛋白在EC 組織中的陽性率和強(qiáng)陽性率分別與正常子宮內(nèi)膜組織中的陽性率和強(qiáng)陽性率比較，采用χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=40.815和31.582，均P=0.000），EC組織均高于正常子宮內(nèi)膜組織（見表1）。

圖1 Mortalin 蛋白在正常子宮內(nèi)膜和各組子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá) （EnVision 法×400）

表1 正常子宮內(nèi)膜組織和EC組織中的Mortalin蛋白表達(dá)陽性率和強(qiáng)陽性率的比較

2.2 EC患者不同因素間Mortalin蛋白強(qiáng)陽性率的比較

Mortalin蛋白高表達(dá)與病理分級、TNM分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性（P＜0.05），但與年齡無關(guān)（P＞0.05）（見表2）。其中，病理分級Ⅲ級的Mortalin蛋白陽性率與Ⅰ級和Ⅱ級比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Ⅲ級Mortalin 蛋白的陽性率高于Ⅰ級和Ⅱ級；TNM分期晚期（Ⅲ、Ⅳ期）的Mortalin蛋白高表達(dá)率與早期（Ⅰ、Ⅱ期）的高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），晚期（Ⅲ、Ⅳ期）高于早期（Ⅰ、Ⅱ期）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Mortalin 蛋白高表達(dá)率與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。根據(jù)該結(jié)果，本研究通過運(yùn)用JMP10 軟件，直觀地展現(xiàn)了Mortalin 蛋白在不同的病理分級、TNM 分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況下的蛋白表達(dá)差異性（見圖2）。

2.3 正常子宮內(nèi)膜組織和EC 組織中的Mortalin mRNA 表達(dá)比較

UALCAN 數(shù)據(jù)庫顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織Mortalin mRNA相對表達(dá)量（109.02±39.25）比較，EC組織Mortalin mRNA相對表達(dá)量（136.42±120.9）較高（t=39.827，P=0.000）（見圖3）。提示Mortalin mRNA在EC 早期診斷、靶向治療和預(yù)后分析中具有重要的作用。

表2 不同因素Mortalin蛋白強(qiáng)陽性率的比較

圖2 不同病理分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況下Mortalin蛋白表達(dá)差異性

圖3 Mortalin mRNA在正常子宮內(nèi)膜組織和EC組織中的表達(dá)比較 （UALCAN數(shù)據(jù)庫）

2.4 Mortalin蛋白高表達(dá)預(yù)示預(yù)后不良

The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計分析結(jié)果表明，Mortalin 蛋白高表達(dá)EC 患者的生存期短于Mortalin 蛋白低表達(dá)EC 患者（χ2= 4.515，P= 0.037）（見圖4）；TCGA 數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，Mortalin mRNA高表達(dá)的EC患者其預(yù)后比Mortalin mRNA低表達(dá)EC 患者差（χ2= 4.475，P= 0.034）（見圖5）。該結(jié)果提示Mortalin 有望成為EC 患者預(yù)后評估的重要新型分子標(biāo)志物之一。

圖4 Mortalin蛋白與EC患者生存期的關(guān)系（The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫）

圖5 Mortalin mRNA與EC患者生存期的關(guān)系（TCGA數(shù)據(jù)庫）

3 討論

Mortalin 蛋白首次在正常小鼠成纖維細(xì)胞質(zhì)中克隆而來，定位于染色體5q31.2，是一種主要位于線粒體的非熱應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白質(zhì)，可以與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)相互作用，具備線粒體產(chǎn)能、分子伴侶、使腫瘤低分化等多種功能[11]，該蛋白在除線粒體以外的其他細(xì)胞器中也同樣起著諸多作用，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞增殖等生物學(xué)功能[12]。有文獻(xiàn)研究結(jié)果顯示[5]，正常情況下Mortalin 蛋白在細(xì)胞中心體通過結(jié)合P53、MPS1等多種基因或激酶來維持原有的造血功能，敲除Mortalin 蛋白使P53、MPS1等不能保持正常細(xì)胞狀態(tài)和染色體穩(wěn)定性，導(dǎo)致骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome, MDS）等疾病的發(fā)生，因此，Mortalin 蛋白是人體不可或缺的基因蛋白。同時，Mortalin 蛋白亦可在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)。研究表明[8]，Mortalin 蛋白在卵巢癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且與臨床分期、分化程度及生存期相關(guān)。CUI 等[6]的研究表明Mortalin 蛋白在胰腺癌組織中與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期等相關(guān)，且Mortalin 蛋白的表達(dá)明顯高于其癌旁組織，可作為胰腺癌的獨立預(yù)后因素；另外，推測其主要機(jī)制是過表達(dá)的Mortalin 蛋白抑制P53 的轉(zhuǎn)錄活性，而這一機(jī)制亦被YI 等[7]學(xué)者推斷為Mortalin 蛋白過表達(dá)促進(jìn)肝癌發(fā)生和進(jìn)展的基礎(chǔ)。截至目前，尚無有關(guān)Mortalin蛋白與子宮內(nèi)膜癌之間關(guān)系的報道。

本研究發(fā)現(xiàn)Mortalin 蛋白表達(dá)定位于EC 細(xì)胞質(zhì)，且在EC 組織中的表達(dá)水平高于正常子宮內(nèi)膜組織。進(jìn)一步分析Mortalin 蛋白過表達(dá)與EC 臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Mortalin 蛋白在病理分級Ⅲ級EC 組織中的高表達(dá)率高于Ⅰ級和Ⅱ級EC 組織；TNM 晚期EC 組織中的高表達(dá)率高于早期EC 組織；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC 組織中的高表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC 組織。本研究結(jié)果表明，隨著EC 疾病的進(jìn)展，Mortalin 蛋白的表達(dá)呈升高趨勢。這一結(jié)果與JIN 等[13]在乳腺癌中Mortalin 蛋白表達(dá)的結(jié)果相符。

本研究運(yùn)用The Human Protein Atlas 和TCGA 數(shù)據(jù)庫來分析Mortalin 蛋白和mRNA 的表達(dá)與EC 患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Mortalin 蛋白和mRNA 高表達(dá)患者的生存期低于低表達(dá)患者，提示Mortalin 過表達(dá)有望成為EC 患者不良預(yù)后的重要新型分子標(biāo)志物。

綜上所述，Mortalin 蛋白在EC 組織中高表達(dá)，且隨著病理分級和臨床分期的升高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈升高趨勢，說明Mortalin 蛋白在EC 的惡性演進(jìn)過程中起重要作用，提示Mortalin 蛋白可以成為EC 預(yù)后評估的分子標(biāo)志物，但其是否可以成為EC 靶向治療的新靶點，則有待進(jìn)一步的深入研究。