基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的扶土生金康復(fù)方調(diào)節(jié)新型冠狀病毒肺炎恢復(fù)期免疫功能機制研究

王博寒，史鎖芳，張曉娜

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)恢復(fù)期患者實驗室檢查細(xì)胞分型表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞(CD4、CD8)比例減少為主[1]，提示恢復(fù)期患者機體仍處于免疫功能低下的狀態(tài)。因此調(diào)節(jié)免疫功能是COVID-19患者恢復(fù)期治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本團(tuán)隊前期觀察了扶土生金康復(fù)方對COVID-19恢復(fù)期(肺脾不足證)患者的臨床療效，研究共納入120例患者，其中，治療組89例患者服用扶土生金康復(fù)方2周后癥狀明顯好轉(zhuǎn)，總有效率達(dá)94.38%，且CD3、CD4、CD8百分比較治療前明顯升高，說明該方能夠有效改善COVID-19恢復(fù)期患者的臨床癥狀和免疫功能[2]。深入研究扶土生金康復(fù)方調(diào)節(jié)機體免疫功能的多靶點、多通路作用機制，對于研發(fā)適宜于COVID-19恢復(fù)期患者的有效新型中藥制劑具有重要的現(xiàn)實意義。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，探究扶土生金康復(fù)方調(diào)節(jié)免疫功能的作用靶點及相關(guān)通路，為其調(diào)節(jié)免疫功能的臨床應(yīng)用提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 扶土生金康復(fù)方來源和組成

史鎖芳教授在傳承國醫(yī)大師周仲瑛教授治疫經(jīng)驗，同時結(jié)合武漢一線抗疫實踐的基礎(chǔ)上，以扶土生金為主，兼顧疏肝解郁寧心創(chuàng)制了扶土生金康復(fù)方，由黨參、黃芪、白術(shù)、法半夏、陳皮、茯苓、山藥、核桃仁、旋覆花、香附、合歡皮、茜草、谷芽、炙甘草等組成。

1.2 扶土生金康復(fù)方的化學(xué)成分及其對應(yīng)靶點挖掘

利用中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)智能信息平臺(http://www.tcmn.cn)[3]，以扶土生金康復(fù)方中的中藥植物拉丁名和靶基因的Official symbol為關(guān)鍵詞提取中藥成分與活性成分相關(guān)的潛在靶點。

1.3 免疫抑制相關(guān)靶點挖掘

以“immunosuppression”為關(guān)鍵詞在GeneCards(https://www.genecards.org/)檢索免疫抑制的相關(guān)靶點，相關(guān)度的排名能夠反應(yīng)靶點與免疫抑制相關(guān)性的大小，篩選Relevance score≥5的靶點進(jìn)行以下研究。

1.4 扶土生金康復(fù)方與免疫抑制交集靶點及功效成分篩選

將在中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)智能信息平臺中獲得的藥物成分靶點與在GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得的免疫抑制相關(guān)靶點進(jìn)行對應(yīng)，獲得扶土生金康復(fù)方與免疫抑制交集靶點。將交集靶點通過Uniprot數(shù)據(jù)庫，規(guī)范為人源(Homosapiens)的標(biāo)準(zhǔn)基因，作為靶點標(biāo)準(zhǔn)化的名稱。

1.5 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

采用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-成分-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。利用String(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫整合扶土生金康復(fù)方與免疫抑制交集靶點的相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 GO富集分析和KEGG富集分析

運用R軟件“clusterProfiler”軟件包對活性成分和疾病的共同靶點進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，設(shè)置P<0.05，得到相應(yīng)柱狀圖和通路圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物與免疫抑制共有靶點的映射

獲得扶土生金康復(fù)方的靶點共1 140個，將其與免疫抑制的相關(guān)靶點461個進(jìn)行映射取交集，獲得扶土生金康復(fù)方治療免疫抑制的潛在靶點118個。

2.2 扶土生金康復(fù)方中藥-成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件，將中藥-成分-作用靶點-疾病數(shù)據(jù)進(jìn)行導(dǎo)入，制作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。圖中共包括1 468個節(jié)點(14味中藥、1 334個成分、118個靶點、1個復(fù)方節(jié)點和1個疾病靶點)，其中藍(lán)色菱形代表靶點，綠色橢圓形代表中藥和成分，紫紅色長方形代表疾病，黃色六邊形代表復(fù)方。Degree值排名前5位的成分是：槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、異鼠李素(isorhamnetin)。Degree值排名前5的靶點是：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Toll樣受體2(TLR2)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、過氧化氫酶(CAT)。

2.3 關(guān)鍵靶點互作圖

將前述118個共同靶點導(dǎo)入String平臺，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點代表靶點，每個節(jié)點之間的線條代表靶點間相互作用關(guān)系，線條多少代表靶點間相互關(guān)聯(lián)的強度(Degree)，不同顏色的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點反映作用的不同證據(jù)類型，Degree值越大，說明靶點相互作用越突出，將Degree值前30的靶點制作關(guān)鍵靶點柱狀圖，見圖2～3。PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)排名前5的白蛋白(ALB)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、腫瘤蛋白p53(TP53)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK3)為扶土生金康復(fù)方調(diào)節(jié)免疫功能的關(guān)鍵靶點。

圖2 藥物-疾病交集靶點互作圖

圖3 前30靶點柱狀圖

2.4 GO功能富集分析

運用R軟件“clusterProfiler”對扶土生金康復(fù)方與免疫抑制的共同靶點進(jìn)行GO富集分析，得到了氣泡圖(圖4) 。氣泡圖橫坐標(biāo)表示基因百分比，圓圈越大富集數(shù)目越高，顏色越紅顯著性越明顯。其中生物過程(BP)相關(guān)條目1 891個，富集最顯著的為T細(xì)胞活化，細(xì)菌來源分子反應(yīng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)，蛋白質(zhì)分泌的調(diào)節(jié)等。分子功能(MF)相關(guān)條目126個，富集最顯著的為蛋白結(jié)合，酰胺結(jié)合，硫化合物結(jié)合等。細(xì)胞組成(CC)相關(guān)條目79個，富集最顯著的為細(xì)胞外區(qū)域部分、膜封閉腔、分泌顆粒內(nèi)腔、質(zhì)膜的外側(cè)面等。

圖4 GO功能富集分析

2.5 KEGG富集結(jié)果分析

進(jìn)行KEGG通路富集分析后得到信號通路142條，按照顯著性程度P值由小到大選取前20條通路，根據(jù)結(jié)果可看出扶土生金康復(fù)方在治療免疫抑制的靶點主要集中在PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路等(圖5)，最顯著的是PI3K-Akt信號通路(圖6)，其中在我們的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)的靶點用紅色方塊標(biāo)明。

圖5 相關(guān)通路KEGG富集分析

圖6 PI3K-Akt信號通路圖

3 討論

COVID-19是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的急性呼吸道傳染病，目前已累計造成世界范圍內(nèi)6 000余萬人次感染?？v然國內(nèi)疫情已經(jīng)基本控制，但感染SARS-CoV-2后的危害與可能的后遺癥不容忽視。SARS-CoV-2感染的突出表現(xiàn)是以炎癥因子風(fēng)暴和淋巴細(xì)胞減少為特征的宿主免疫紊亂[4]。免疫紊亂包括病毒感染后期的免疫抑制階段，其特征是COVID-19患者出現(xiàn)外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)減少，尤其表現(xiàn)為CD4、CD8 T淋巴細(xì)胞持續(xù)性且顯著性降低[5]。同時大量糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用也會出現(xiàn)免疫抑制的情況，甚至患者會出現(xiàn)急性免疫功能缺陷，增加了病毒清除延遲和再次感染的風(fēng)險[6]。迄今為止，臨床上尚無調(diào)節(jié)COVID-19免疫功能的特效藥物，因此，尋求有效的COVID-19恢復(fù)期促康復(fù)中藥具有重要的現(xiàn)實意義。團(tuán)隊史鎖芳教授前期深入武漢一線抗疫，臨床研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19恢復(fù)期患者CD3、CD4、CD8百分比在無藥物干預(yù)的情況下大多處于較低水平，提示該類患者出院后仍處于免疫低下狀態(tài)。針對COVID-19恢復(fù)期肺脾不足證患者，給予扶土生金康復(fù)方治療取得較好的臨床療效，且能調(diào)節(jié)患者的免疫功能。全方緊扣恢復(fù)期患者肺脾不足，兼有肝氣郁結(jié)，心神失寧的病機特點，以黨參、黃芪益氣健脾，扶土生金為君藥，以白術(shù)、山藥、核桃仁健脾燥濕，益腎納氣為臣藥；半夏、陳皮、茯苓、谷芽健脾化痰，理氣開胃，合歡皮、香附、旋覆花、茜草疏肝解郁，寧心安神，活血和絡(luò)，共為佐藥，使以炙甘草取調(diào)和諸藥，全方補益肺脾，取培土生金之意，土能生金，金得土助，則生化無窮，另外，配伍解郁寧心和絡(luò)之品也是本方獨特之處[2]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究扶土生金康復(fù)方調(diào)節(jié)COVID-19恢復(fù)期肺脾不足證患者免疫功能的機制，揭示該康復(fù)方中作用于免疫抑制的關(guān)鍵化學(xué)成分主要為槲皮素、木犀草素等，分別來自于本方的君藥黃芪和黨參。槲皮素是一種具有多種生物活性的天然黃酮類化合物，具有調(diào)節(jié)免疫的作用。王福生院士等研究發(fā)現(xiàn)COVID-19患者外周血Th17的增加和CD8 T淋巴細(xì)胞的高細(xì)胞毒性是導(dǎo)致免疫損傷的主要機制[7]。相關(guān)實驗研究表明槲皮素能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞亞群分化，抑制病理性CD4 T淋巴細(xì)胞[8]，對免疫細(xì)胞具有雙相調(diào)節(jié)作用[9]。張桐茂等研究表明槲皮素通過調(diào)控Th17和Treg細(xì)胞的平衡對大鼠肺部免疫功能起到調(diào)節(jié)作用[10]。木犀草素在自然界中分布廣泛，多以糖苷的形式存在于多種植物中。周亮等研究表明木犀草素能夠提高肺癌大鼠血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育和分化，提高機體免疫功能[11]。綜上提示，扶土生金康復(fù)方中的槲皮素和木犀草素對COVID-19免疫損傷能夠起到調(diào)節(jié)作用。

扶土生金康復(fù)方藥物-成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值排名靠前的靶點是：mTOR、TLR2、TNF等。提示這些靶點是扶土生金康復(fù)方調(diào)節(jié)免疫抑制的關(guān)鍵靶點。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖與代謝等發(fā)揮免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用[12-13]。mTOR參與初始CD4+T細(xì)胞的分化，表現(xiàn)為激活STAT4和T-bet途徑促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，激活STAT6和GATA3途徑促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，激活STAT3和RORγt途徑促進(jìn)Th17細(xì)胞分化[14]。Toll樣受體(TLR)是一種病原相關(guān)分子模式受體，可調(diào)控多種細(xì)胞因子的表達(dá)及Th1與Th2細(xì)胞的免疫平衡等,參與機體的炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答過程[15]。TLR2主要分布于樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞表面。TLR2通過與TLR1或TLR6形成異源二聚體識別微生物中的脂肽、脂蛋白等結(jié)構(gòu)[16]，隨后胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域募集Myd88，激活下游信號分子IRAKs、TRAF6、IκKs，進(jìn)而激活NF-κB，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α的生成[17]，故激活TLR2可以快速啟動固有免疫，同時調(diào)控體內(nèi)獲得性免疫應(yīng)答。通過String平臺構(gòu)建的靶點互作圖看出，ALB、TNF、AKT1等為關(guān)鍵靶點。TNF是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，可直接作用于T細(xì)胞、B細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞MHC-Ⅰ類抗原表達(dá)，增強依賴IL-2的胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)IL-2、巨噬細(xì)胞集落刺激因子等淋巴因子產(chǎn)生[18]，能夠在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用，組織免疫細(xì)胞之間的交流[19]。

KEGG富集分析顯示，TLR4、TLR2、AKT、JAK、TP53、ERK、MTOR等多個蛋白靶點主要富集在PI3K-Akt信號通路上，PI3K是一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，是由調(diào)節(jié)亞基和催化亞基組成的異源二聚體，Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為PI3K信號通路中極為重要的下游效應(yīng)分子[20]，它能調(diào)控各種不同細(xì)胞功能，包括代謝、生長、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成等[21]。初始CD4細(xì)胞在不同細(xì)胞因子作用下可分化為功能不同的輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)，其中Th細(xì)胞又分為Th1、Th2及Th17等亞群，這些細(xì)胞亞群通過細(xì)胞因子的分泌相互影響，相互制約，形成一個CD4+T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[22-23]。

綜上，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示了扶土生金康復(fù)方在COVID-19恢復(fù)期患者治療中多成分、多靶點、多通路的調(diào)控特點，提示本方中槲皮素、木犀草素、柚皮素等活性成分通過T細(xì)胞活化、氧化應(yīng)激等參與體內(nèi)生物過程以及調(diào)控PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路等方式調(diào)節(jié)免疫功能，為扶土生金康復(fù)方治療COVID-19恢復(fù)期的作用機制研究提供了有益線索。有關(guān)本方中君、臣、佐、使各藥調(diào)節(jié)免疫功能作用強度差別尚需進(jìn)一步深入研究。