牛皰疹病毒Ⅰ型檢測技術概述

張帆 王禹淳 姜坤生 李思瑤 宋佰芬

摘 要：牛皰疹病毒Ⅰ型（BoHV-1）可以引起多種臨床疾病，如牛傳染性鼻氣管炎（IBR）、傳染性膿皰性外陰陰道炎（IPV）以及結膜炎等，是牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，對乳牛產奶量、公牛繁殖力及役用牛的使役力均有較大影響，每年造成極大的經(jīng)濟損失。牛皰疹病毒Ⅰ型的早期準確診斷和治療對于該病的防控具有重要作用。目前，牛皰疹病毒Ⅰ型的檢測方法主要有臨床診斷、病原學診斷和血清學診斷等，各有優(yōu)缺點。該文總結概述了牛皰疹病毒Ⅰ型的各種常用診斷方法，旨在為該病的進一步研究和診斷防控提供參考。

關鍵詞：BoHV-1;臨床診斷;病原學診斷;分子生物學診斷;血清學診斷

中圖分類號 S852.65+9.1文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）02-0093-05

Overview of Bovine Herpesvirus Type I Detection Technology

ZHANG Fan et al.

（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319，China ）

Abstract： Bovine Herpesvirus Type I （BoHV-1） can cause a variety of clinical diseases，such as bovine infectious rhinotracheitis （IBR），infectious pustular vulvovaginitis （IPV） and conjunctivitis. It is an acute，heat and contact infectious disease of cattle. It has a great impact on the milk yield of dairy cows，the fertility of bulls and the enabling power of cattle. It causes great economic losses. The early accurate diagnosis and treatment of bovine herpesvirus type I plays an important role in the prevention and control of the disease. At present，the detection methods of bovine herpesvirus type I mainly include clinical diagnosis，pathogenic diagnosis，and serological diagnosis，and each has its own advantages and disadvantages. This articlesummarizes the various commonly used diagnostic methods for bovine herpesvirus type I，aiming to provide reference for further research and diagnosis and prevention of the disease.

Key words： BoHV-1;Clinical diagnosis;Pathogenic diagnosis;Molecular biological diagnosis;Serological diagnosis

牛皰疹病毒Ⅰ型（bovine herpesvirus type-1，BoHV-1）是一種粒子直徑為150～200nm、具有脂質囊膜的DNA球狀病毒，該病毒具有162個殼粒的20面體核衣殼[1]。BoHV-1的基因組全長為13.3Kb，可編碼80多個蛋白質。除非結構蛋白外，BoHV-1還包含gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM等發(fā)揮主要功能的結構蛋白，其中編碼基因位于BoHV-1長獨特區(qū)的有gB、gC、gH、gK、gL、gM等糖蛋白，編碼基因位于BoHV-1短獨特區(qū)的有gD、gE、gG、gI等糖蛋白。這些結構糖蛋白的主要功能是在病毒感染過程中配合完成病毒的吸附、滲透、復制和組裝等過程。例如，gB、gC、gD糖蛋白是刺激宿主產生免疫應答反應的最主要的幾種抗原蛋白[2-4]。

BoHV-1在養(yǎng)牛業(yè)可引起多種傳染性臨床疾病，在我國多個省市地區(qū)廣泛流行，對奶牛產奶量、肉牛繁殖力及生產率均有極大影響，在全球范圍內造成重大經(jīng)濟損失。1956年Madin等[5]首次從患病牛體內成功分離出BoHV-1，1964年Huck[6]對BoHV-1進行鑒定并成功確認該病毒屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科。20世紀80年代，歐洲西部多個國家地區(qū)暴發(fā)了極其嚴重的牛傳染性鼻氣管炎[7]。與此同時，國內周泰沖等[8]在進口種牛中發(fā)現(xiàn)了BoHV-1并對其進行了分離鑒定。近年來，國內BoHV-1的血清學調查結果顯示：河南、四川、貴州、廣東、廣西、山東、新疆等地區(qū)的黃牛、水牛和中國荷斯坦奶牛中均出現(xiàn)BoHV-1感染現(xiàn)象[9]。

BoHV-1侵入宿主體內細胞后，通過微管途徑利用其自身含有的多種功能性蛋白的吸附、入侵和運輸功能將病毒運輸至細胞核內，并利用宿主細胞本身所具有的各種物質完成復制過程，離開核膜后，BoHV-1先完成外部囊膜的包被，然后通過囊泡的運輸作用排除到細胞外，完成釋放過程[10]。BoHV-1最大特點是組織侵染力強，可以感染多個組織，包括呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、多處粘膜和胎兒[11]。BoHV-1初次感染宿主后，病毒粒子可以沿感覺神經(jīng)進行遷移，最終以DNA的形式繼續(xù)存在于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)原細胞內。當病毒接受刺激性藥物的治療，或者氣候、飼養(yǎng)條件的改變以及較為惡劣的運輸條件，都可以使?jié)摲鼱顟B(tài)的的病毒重新激活，在潛伏感染動物的上皮細胞內進行大量增殖和擴散，使畜體重新患病。因此，BoHV-1感染牛病愈后，有可能依舊攜帶有該病毒。除此之外，羚羊、糜鹿、角馬、水貂等多種野生動物都是攜帶BoHV-1的主要宿主動物，它們不表現(xiàn)BoHV-1的臨床癥狀卻攜帶并擴散該病毒，因此該病極難完全清除[12，13]。

1 臨床診斷

BoHV-1主要包括呼吸道亞型和生殖道亞型2類。當動物被病毒感染后，患病動物會根據(jù)侵染病毒的亞型表現(xiàn)出對應的臨床表現(xiàn)，主要臨床癥狀為發(fā)熱、口鼻和氣管黏膜出現(xiàn)炎癥反應、劇烈咳嗽和呼吸困難等，部分動物同時表現(xiàn)出結膜炎、腦炎、陰道炎、母牛流產及死胎等癥狀[14]。除此之外，BoHV-1侵染機體后在機體內會呈現(xiàn)潛伏感染的狀態(tài)，存在于各種神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)細胞中，在應激反應的刺激下會重新向外部排除病毒體，使其再次成為傳染源，因此BoHV-1極難進行有效的防治和根除。雖然可以根據(jù)患病動物的臨床癥狀和病理解剖對BoHV-1進行初步診斷，但無法明確診斷，因此必須采取病原學診斷和血清學診斷等方法對BoHV-1進行確診，以便后續(xù)的精準治療。

2 病原學檢測

BoHV-1的病原學診斷技術主要包括電鏡檢查、病毒分離鑒定實驗和多種分子生物學檢測方法等。病原學診斷具有特異性強、準確性高、敏感性強等特點。其中，以核酸為主要檢測基礎的分子生物學檢測方法是通過對目標的特異性片段進行診斷，結果準確率高，因而在實驗室和實際應用中均得到了廣泛使用。

2.1 電鏡觀察 根據(jù)BoHV-1所引起的疾病類型的不同從而收取患病動物不同組織的粘膜液負染后進行電鏡檢查是一種相對可靠的方法，也可以使用抗BoHV-1的高免血清使病毒粒子在體外形成特異性凝集現(xiàn)象，從而有助于電鏡觀察確診。楊盛華等[15]利用電鏡對BoHV-1進行過觀察。但是，電鏡觀察采集的病毒樣品不能經(jīng)過反復凍融，也不能添加有機溶劑處理，否則會損傷病毒粒子表面的蛋白，從而使病毒喪失表面特征，不利于病毒粒子的辨認。在電鏡視野范圍內，BoHV-1病毒粒子直徑為150～200nm，為圓球狀，最外層為一層脂質囊膜，囊膜表面含有多個結構蛋白凸起，整體如花粉狀。但是，相較其他方法而言，使用電鏡觀察BoHV-1，具有價格昂貴、操作復雜、時間較長等缺點，并且對操作人員的實驗技巧有一定的要求，因此目前很少使用。

2.2 病毒分離鑒定 臨床檢測上，根據(jù)患病動物不同的發(fā)病癥狀，需要收集不同的組織樣品：患有鼻氣管炎的病畜需要使用棉棒采集病畜的鼻粘膜液和眼粘膜分泌液;患有傳染性外陰陰道炎的患病母牛需要使用棉棒擦拭或者生理鹽水沖洗采集外陰部黏液和陰道分泌物，患病公牛則需要使用生理鹽水沖洗采集包皮內側分泌物和患病公牛的精液;患病流產母牛需要采集死胎的粘膜液和實質臟器;患有腦炎的病畜需要采集部分腦組織[16]。

BoHV-1的病毒分離鑒定主要是利用牛腎或睪丸的單層細胞、牛腎傳代細胞（MDBK）對臨床上采集的病毒樣品進行一定的處理，從而進行分離和鑒定。一般標準MDBK細胞接毒后2～5d就會產生明顯的細胞病變效應（Cytopathic effect，CPE）。當細胞形態(tài)發(fā)生改變，逐漸變圓縮小、聚集成團并出現(xiàn)明顯的細胞病變時，就基本可以確診為BoHV-1感染。但是，由于病毒的分離過程較復雜、耗費時間較長、對實驗設備要求較高且容易出現(xiàn)污染等缺點，因此BoHV-1的病毒分離鑒定只能作為實驗室診斷方法之一，在實際生活中基本不使用[17]。Terpstra等[18]采集病牛的鼻粘膜液并使用直接熒光抗體法對其進行檢測，結果表明在接種后2～8d全部人工感染牛均檢測到了病毒粒子。之后，免疫酶實驗和放射免疫測定也被用于BoHV-1的檢測，但由于這些方法敏感性低、耗時耗力且易受各種不確定因素的影響，無法被廣泛應用。

2.3 分子生物學診斷 BoHV-1的核酸檢測方法主要有多種聚合酶鏈式反應以及脫氧核糖核酸雜交檢測技術。分子生物學方法通過一定的技術手段在體外對目標基因片段DNA進行快速擴增，從而進行檢測確認。與其他病原學檢測方法和血清學檢測方法相比較而言，分子生物學方法具有檢測速度快、準確性高、特異性強等優(yōu)點，因此在各領域都具有廣泛應用。

2.3.1 聚合酶鏈式反應（PCR） 1993年Englenburg等[19]開始使用PCR技術對BoHV-1進行檢測。此后，多位研究人員研究并建立了BoHV-1的聚合酶鏈式反應檢測方法。王嵩等[20]根據(jù)NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的BoHV-1 gB基因設計引物，對退火溫度等條件進行多次優(yōu)化后建立了一種快速檢測BoHV-1的PCR方法。林梅等[21]根據(jù)BoHV-1 tk基因序列建立了的BoHV-1 PCR檢測方法，可用于養(yǎng)殖場BoHV-1防控檢測手段。

2.3.2 巢式聚合酶鏈式反應（Nested-PCR） 巢式聚合酶鏈式反應是一種通過2次相繼進行的聚合酶鏈式反應共同組成的一種PCR技術，因為2次PCR在首次PCR反應產物的基礎上進行了再次的迅速擴增，因此Nested-PCR的特異性和成功率大大提高。SA Masri等[22]通過實驗條件的優(yōu)化，利用Nested-PCR成功檢測BoHV-1感染公牛精液中的BoHV-1病毒。對于常用于牛人工授精的精液，PCR測定法檢測到精液中的BoHV-1較病毒分離方法特異性強、敏感性高、準確性高。

2.3.3 LUX新型熒光PCR（LUX-PCR） LUX新型熒光PCR的基本原理是設計1條帶有末端回文結構，并在3′末端標記熒光素的熒光定量PCR特異性單標引物。在游離狀態(tài)下，這條引物可形成發(fā)夾結構，而這種帶有末端回文結構的核酸構象本身具有淬滅熒光基團的功能特性，因此不需要在另一端標記淬滅基團。LUX利用這種標記熒光素的特異性單標引物的內在特性，從而更加簡單地對待測目的基因實時熒光定量檢測。當特異性單標引物和模板片段配對開始進行復制時，發(fā)夾打開，釋放熒光，熒光信號顯著增加，可以用機器進行定量[23]。陳茹[24]使用該方法檢測BoHV-1，全程僅需約2h，敏感性高，可用于臨床快速檢測BoHV-1病毒。

2.3.4 實時熒光定量PCR（Real-time PCR） 實時熒光定量PCR是一種使用熒光物質實時測定每次PCR擴增后產物總量并依靠內參或外參對待測樣本中含有的目的片段進行定量分析檢測。實時熒光定量PCR技術的基本原理是將標記有熒光素的Taqman探針加入到PCR擴增體系中，遵守PCR的基本規(guī)律從而完成PCR擴增過程。當目的片段開始擴增時，Taqman探針和與其互補配對結合的模板DNA分開，在特定光下發(fā)出熒光;隨著循環(huán)次數(shù)增加，被擴增的目的片段指數(shù)增長[25]，通過檢測不同時間點增強的熒光信號強度即可求得Ct值;同時利用多個標準品作為實驗對照，即可得出最終待測樣品目的基因的具體拷貝數(shù)。Chandranaik BM[26]等通過間接ELISA方法和病毒分離對比檢測精液和拭子臨床樣本中的BoHV-1，發(fā)現(xiàn)實時PCR測定法具有100%的靈敏度和87.19%的特異性。

2.3.5 核酸探針檢測 核酸探針普遍帶有發(fā)光或放射性標記物，是一種可以被檢測到的已知具體序列的核酸片段，它可以結合到與其能相互配對的核酸序列上形成雙鏈，因此可被用于檢測含有特定核酸序列。針對某種病毒獨有的核酸片段并對其進行一定的改造和標記，這些核酸片段就能制備出可以檢測該病原體的探針。近年來，核酸探針已被廣泛應用于各種細菌真菌和病毒檢測，為流行病學的調查研究和臨床診斷提供了一定的方法和檢測依據(jù)。吳時友等[27]從純化的BoHV-1提取全基因組，并使用32P對其進行標記改造制作可以檢測BoHV-1的探針，進而進行點雜交實驗。試驗結果顯示，探針具有較強的特異性和敏感性，能明顯區(qū)分細胞是否被BoHV-1感染。隨后實驗證明，生物素也可以替代32P，制備的探針效果良好。非放射性同位素標記的探針可以在-20℃的條件下保存1年以上，不僅可以減少放射性同位素探針對人體造成的傷害，還有利于推廣和應用，是一種不錯的選擇[28]。

2.3.6 重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA） 重組酶聚合酶擴增技術是近年來發(fā)現(xiàn)的一種通過可以結合單鏈核酸的重組酶、單鏈結合蛋白和鏈置換DNA聚合酶相互作用、協(xié)同完成的，與PCR具有相同功能的核酸檢測技術[29]。RPA技術的基本原理是先使用可以結合單鏈核酸的重組酶與引物結合復合物，之后該復合物能夠在雙鏈DNA中尋找并定位同源序列進而啟動同源序列的合成，對目標片段進行擴增。由于3種物質的相互配合，整個合成過程速度很快，大約10min便可檢測出擴增產物。RPA引物比一般PCR引物長，一般要達到35個堿基，因此擴增引物和探針的設計對于RPA來說尤為重要。引物的變性溫度不是影響擴增引物的關鍵因素。引物太短會導致重組率降低，對于目的片段的擴增速度和檢測目的片段的靈敏度都具有較大影響[30-31]。Peili Hou、王紅梅等[32]以BoHV-1的特異性保守UL52區(qū)片段設計引物和探針，使用重組酶聚合酶擴增技術成功檢測BoHV-1，且BoHV-1 LFD-RPA與實時PCR之間的一致性為100%。

3 血清學檢測

3.1 中和試驗 中和試驗是BoHV-1常用且經(jīng)典的的血清學診斷方法，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的國際貿易檢測方法之一，同時也是我國動物檢疫的常用檢測方法[33]，適用于各種流行病學調查。BoHV-1中和實驗的基本原理是將經(jīng)過倍比稀釋的待檢血清和已經(jīng)測得病毒滴度的標準BoHV-1中和反應后接種于已經(jīng)培養(yǎng)狀態(tài)良好的96孔板中的MDBK細胞中，之后培養(yǎng)觀察，若出現(xiàn)BoHV-1特異性細胞病變，則說明該血清樣品為BoHV-1中和抗體陽性，同時還可根據(jù)抑制MDBK細胞出現(xiàn)細胞病變的血清最終稀釋濃度計算出血清的中和抗體滴度[34]。由于中和試驗步驟復雜、時間較長且容易受到其他因素影響，導致結果并不準確，因此在BoHV-1的臨床檢測時一般不使用中和實驗，多使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA）進行檢測。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種利用結合于固體承載物上的抗原抗體的專一結合特性的檢測技術。因其具有操作簡便、敏感快捷、標準化程度高等優(yōu)點，因此在多個行業(yè)中得到迅速發(fā)展和廣泛應用，在BoHV-1的臨床診斷和檢疫檢測中發(fā)揮著舉足輕重的作用。通常，人們使用免疫原性良好的的BoHV-1囊膜糖蛋白（如gB、gC、gD、gE、gG等糖蛋白）作為診斷靶蛋白來建立BoHV-1抗原抗體檢測ELISA。gB糖蛋白是BoHV-1在宿主細胞中病毒增殖過程中不可或缺的蛋白。曹翀等[35]成功純化gB糖蛋白，建立并優(yōu)化了間接ELISA檢測BoHV-1。目前，市場上已有標準商品化的gB糖蛋白阻斷ELISA檢測試劑盒并投入使用。gC糖蛋白是在病毒囊膜表面和感染細胞膜上表達量最多的糖蛋白，免疫原性良好，能夠引起體液免疫和細胞免疫。馬輝等[36]成功表達和純化了BoHV-1 gC糖蛋白，并制備了gC糖蛋白的單克隆抗體，以此為基礎建立了BoHV-1雙抗體夾心ELISA檢測方法。gD糖蛋白是BoHV-1免疫原性最好的糖蛋白，能夠誘導機體發(fā)生體液免疫應答和細胞免疫應答，常被作為亞單位疫苗的首選蛋白[37]。周躍輝[38]成功表達和純化了BoHV-1 gD蛋白，并制備了gD糖蛋白的單克隆抗體，以此為基礎建立了BoHV-1雙抗體夾心ELISA。gE糖蛋白與病毒在宿主體內順行和神經(jīng)毒性密切相關，是中和抗體的主要靶蛋白之一，目前已經(jīng)建立了以gE糖蛋白作為診斷靶蛋白的gE糖蛋白阻斷BoHV-1診斷方法[39]。gG糖蛋白也具有很強的免疫原性。王冰[40]以純化的gG糖蛋白制備單克隆抗體，以此為基礎建立了BoHV-1競爭ELISA檢測方法，對于BoHV-1的流行病學調查具有重要應用價值和意義。2016年Casarin E等[41]建立了一種以抗生物素蛋白—核酸組裝體（avidinnucleicacidnanoassembly，ANANAS）為基本反應底物的新型ELISA。與傳統(tǒng)的ELISA相比，ANANAS技術最顯著的區(qū)別是將由辣根過氧化物酶標記抗體替換成了使用生物素蛋白-HRP標記抗體，這是一種納米級的膠狀抗生物素蛋白，并且可以將免疫信號放大從而應用于免疫診斷[42]。

3.3 瓊脂擴散試驗 瓊脂擴散試驗的基本原理為可溶性抗原與相應抗體在含有電解質的半固體凝膠（瓊脂或瓊脂糖）中可以發(fā)生沉淀反應，既可以利用BoHV-1來檢測血清中是否含有抗體，也可以利用BoHV-1陽性血清來檢測組織中是否含有BoHV-1。1993年Suresh S[43]在前人研究基礎上建立了免疫擴散和對流免疫擴散檢測BoHV-1的方法。該方法操作簡單，成本較低，但敏感性不強，不適用于BoHV-1的臨床診斷。

4 展望

隨著我國規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，BoHV-1的流行及其對養(yǎng)牛業(yè)的威脅也日趨嚴重，對于BoHV-1的根除或控制計劃勢在必行。隨著科學技術的發(fā)展和進步，該病的診斷方法也在不斷完善，各種快速有效的臨床診斷方法也得到了廣泛應用，但不同的診斷方法都有其優(yōu)點和不足，實際應用中還應因地制宜選擇合適的診斷方法。自從BoHV-1發(fā)現(xiàn)以來，人們一直在探尋更加簡便、快捷、精準的臨床診斷方法。病毒分離方法時間長且易受外界因素影響。核酸檢測技術形式多樣、靈敏度高、特異型強，但對于儀器和操作人員要求較為嚴格。中和試驗、間接血凝試驗、瓊脂擴散試驗以及酶聯(lián)免疫吸附試驗等血清學診斷方法具有簡便、快速等優(yōu)點，但由于BoHV-1具有潛伏感染的特性，因此即使牛群血清抗體陰性，仍難以保證牛群就沒有BoHV-1感染。新材料，新技術的發(fā)展推動了新儀器和新的診斷技術的產生，隨著科學技術的不斷發(fā)展，根除BoHV-1的計劃終將成為現(xiàn)實。

參考文獻

[1]王單晶.牛傳染性鼻氣管炎阻斷ELISA抗體檢測方法的建立與應用[D].武漢：華中農業(yè)大學，2013.

[2]馬瑜，孟紅.單純皰疹病毒侵入相關糖蛋白的研究進展[J].國際病毒學雜志，2006，13（3）：94-96.

[3]Varela A P M，Holz C L，Cibulski S P，et al. Neutralizing antibodies to bovine herpesvirus types 1（BoHV-1） and 5（BoHV-5） and its subtypes.[J]. Veterinary Microbiology，2010，142（3-4）：254-260.

[4]姜良，黃秀芬，王天坤，等.牛皰疹病毒1型gE蛋白胞外區(qū)基因的桿狀病毒表達及其表達產物的免疫反應性[J].中國獸醫(yī)科學，2014（9）：915-920.

[5]王麗榮，董永軍，姚四新.牛傳染性鼻氣管炎病毒病的病原學及診斷[J].豬業(yè)科學，2004，21（3）：60-61.

[6]孟日增，石建平，肖成蕊，等.牛傳染性鼻氣管炎（IBR）診斷方法研究進展[C]//吉林省畜牧獸醫(yī)學會2007學術年會論文集，2007.

[7]加爾肯，劉建華，冉多良.牛布魯氏菌和牛皰疹病毒雙重PCR檢測方法的建立[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2013（7）：21-22.

[8]周泰沖，葉章明，黎少權，等.從新西蘭進口奶牛中分離傳染性牛鼻道氣管炎病毒[J].中國獸醫(yī)科技，1981（1）：8-11，2.

[9]封啟民，楊冰清，李昌琳，等.我國牛傳染性鼻氣管炎血清抗體普查報告[J].中國動物檢疫，1982（00）：40-43.

[10]張小龍，湯貝貝，何玉鳳，等.BALB/c小鼠作為單純皰疹病毒1型感染模型的免疫學分析[J].微生物與感染，2017，12（4）：222-228.

[11]陳國花，邵洪運.牛傳染性鼻氣管炎的類型及診治[J].現(xiàn)代畜牧科技，2011（6）：104-105.

[12]殷震，劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社，1997：1019-1020.

[13]王永艷，王仲兵，鄭明學，等.牛傳染性鼻氣管炎的流行與防控[J].動物醫(yī)學進展，2010，31（1）：112-115.

[14]Puentes R，Campos F S，F(xiàn)urtado A，et al. Comparison between DNA Detection in Trigeminal Nerve Ganglia and Serology to Detect Cattle Infected with Bovine Herpesviruses Types 1 and 5[J]. Plos One，2016，11（5）：e0155941.

[15]楊盛華，武銀蓮，鄒嘯環(huán)，等.動物3種DNA病毒在宿主細胞內形態(tài)發(fā)生比較[J].中國獸醫(yī)學報，1992（1）：60-64.

[16]Deim Z，Szeredi L，Egyed L. Detection of bovine herpesvirus 4 DNA in aborted bovine fetuses[J]. Canadian journal of veterinary research=Revue canadienne de recherche vétérinaire，2007，71（3）：226-229.

[17]宋文超，金業(yè)，吳文浩，等. 傳染性牛鼻氣管炎病毒分離鑒定及特性分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2012，44（6）：31-34.

[18]Terpstra C. Diagnosis of infectious bovine rhinotracheitis by direct immunofluores-cence[J]. Tijdschrift Voor Diergeneeskunde，1979，104（14）：suppl 138-144.

[19]Chowdhury S I. BHV-1 gene-deleted virus vaccine：EP，US6284251[P]. 2001.

[20]王嵩，林紅麗，王宇鵬，等.牛傳染性鼻氣管炎病毒PCR檢測方法的建立及初步應用[J].黑龍江八一農墾大學學報，2014（3）：26-29.

[21]林梅.上海地區(qū)牛傳染性鼻氣管炎感染情況調查及病毒分離鑒定[D].南京：南京農業(yè)大學，2014.

[22]Masri S A，Olson W，Nguyen P T，et al. Rapid detection of bovine herpesvirus 1 in the semen of infected bulls by a nested polymerase chain reaction assay[J]. Canadian journal of veterinary research=Revue canadienne de recherche vétérinaire，1996，60（2）：100-107.

[23]陳茹，劉琳琳，曾彩云，等.牛皰疹病毒Ⅰ型二重LUX熒光PCR鑒別檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學，2007，37（11）：944-949.

[24]陳茹，畢英佐，曹永長，等.牛傳染性鼻氣管炎病毒LUX^TM新型熒光PCR檢測方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2007，29（4）：303-307.

[25]Pawar S S，Meshram C D，Singh N K，et al. Development of a SYBR Green I based duplex real-time PCR for detection of bovine herpesvirus-1 in semen[J]. Journal of Virological Methods，2014，208：6-10.

[26]Chandranaik B M，Rathnamma D，Patil S S，et al. Development of a probe based real time PCR assay for detection of bovine herpes virus-1 in semen and other clinical samples[J]. Indian Journal of Virology，2013，24（1）：16-26.

[27]吳時友，吳明杰，宮云浩.應用～（32）P標記核酸探針檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的研究初報[J].中國獸醫(yī)雜志，1988（5）.

[28]羅文永，胡駿，劉文華，等.核酸探針中放射性同位素的快速檢測[J].中國細胞生物學學報，2004，26（3）：324-326.

[29]高威芳，朱鵬，黃海龍.重組酶聚合酶擴增技術：一種新的核酸擴增策略[J].中國生物化學與分子生物學報，2016，32（6）：627-634.

[30]樊曉旭，趙永剛，李林，等.重組酶聚合酶擴增技術在疾病快速檢測中的研究進展[J].中國動物檢疫，2016，33（8）：72-77.

[31]景志剛，董浩，狄棟棟，等.重組酶聚合酶擴增技術研究進展[J].生物技術通報，2016，32（6）：47-53.

[32]Hou P，Wang H，Zhao G，et al. Rapid detection of infectious bovine Rhinotracheitis virus using recombinase polymerase amplification assays[J]. Bmc Veterinary Research，2017，13（1）：386.

[33]House J A，Baker J A. Bovine herpesvirus IBR-IPV. The antibody virus neutralization reaction[J]. Cornell Veterinarian，1971，61（2）：320.

[34]Donofrio G，Cavirani S，Vanderplasschen A，et al. Recombinant Bovine Herpesvirus 4 （BoHV-4） Expressing Glycoprotein D of BoHV-1 Is Immunogenic and Elicits Serum-Neutralizing Antibodies against BoHV-1 in a Rabbit Model[J]. Clinical & Vaccine Immunology，2006，13（11）：1246.

[35]曹翀，曹永生，宋林，等.牛傳染性鼻氣管炎病gB蛋白的截短表達及間接ELISA方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2015，37（2）：123-127.

[36]馬輝，邊傳周，王永芬，等.牛傳染性鼻氣管炎病毒gC蛋白單克隆抗體的制備與初步應用[J].畜牧獸醫(yī)學報，2013，44（10）：1637-1644.

[37]李漢雄，劉瑞寧，張芳，等.重組病毒BoHV-1gG^-/tk^-/gD^+和BoHV-1gG^-/tk^-/gD5^+的兔體內安全性和免疫原性[J].微生物學通報，2017，44（12）：2967-2980.

[38]周躍輝.牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白gD單抗制備及其抗原表位鑒定與雙抗夾心ELISA的建立[D].北京：中國農業(yè)科學院，2015.

[39]Earley B，Tiernan K，Duffy C，et al. Effect of suckler cow vaccination against glycoprotein E（gE）-negative bovine herpesvirus type 1（BoHV-1） on passive immunity and physiological response to subsequent bovine respiratory disease vaccination of their progeny[J]. Research in Veterinary Science，2018：43-51.

[40]王冰.針對gG基因的牛傳染性鼻氣管炎病毒新型檢測方法建立和應用[D].武漢：華中農業(yè)大學，2011.

[41]Casarin E，Lucchese L，Grazioli S，et al. A New ELISA Using the ANANAS Technology Showing High Sensitivity to diagnose the Bovine Rhinotracheitis from Individual Sera to Pooled Milk[J]. Plos One，2016，11（1）：e0145912.

[42]Casonato A，Pontara E，Morpurgo M，et al. Higher and lower active circulating VWF levels： different facets of von Willebrand disease[J]. British Journal of Haematology，2015，171（5）：845-853.

[43]Suresh S.Detection of BHV-1 in bovine by immunodiffusion and counter immunoelectrophoresis test[J].J Bombay VetCollege，1993，4：37-40.

（責編：徐世紅）