超聲輔助β-環(huán)糊精包合法提取紫蘇籽油α-亞麻酸工藝研究

(王 亞 范玲玲 馬挺軍

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院1，北京 102206)

(鄂倫春自治旗大楊樹榮盛商貿(mào)有限責(zé)任公司2，呼倫貝爾 021000)

紫蘇[Prillafrutescens(L.) Brittt.]，別名荏、紅蘇、赤蘇、白蘇、灰蘇、蘇子等，為唇形科紫蘇屬一年生草本植物，是亞洲起源中心起源農(nóng)作物，我國種植紫蘇已有300 0多年的歷史[1]。紫蘇籽油是由紫蘇籽經(jīng)提取所得到的植物油，紫蘇籽油中含有α-亞麻酸、油酸、亞油酸、硬脂酸等脂肪酸，其中α-亞麻酸的純度高達(dá)60%以上[2，3]。α-亞麻酸(α-Linolenic acid) 即9，12，15-十八碳三烯酸，是n-3系列不飽和脂肪酸[4]。α-亞麻酸作為一種不能自身合成的多不飽和脂肪酸，在人體內(nèi)會轉(zhuǎn)化為二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，即EPA和DHA[5]。據(jù)報(bào)道，這類n-3系列不飽和脂肪酸具有降血脂、降血糖、提高記憶力、抗癌[6-8]等功效。

目前常規(guī)的α-亞麻酸的提取工藝主要有尿素包合法、銀離子絡(luò)合法、冷凍結(jié)晶法、分子蒸餾法、柱層析法、超臨界流體萃取法等，利用尿素包合法提取α-亞麻酸包合時(shí)間長并且有機(jī)溶劑殘留[9]；銀離子絡(luò)合法成本較高，而且硝酸銀具有不穩(wěn)定性，需要對銀離子進(jìn)行回收[10]；冷凍結(jié)晶法需要回收大量溶劑，如正己烷等[11]；柱層析法溶劑使用量大，分離時(shí)間較長，能耗大，洗脫過程中使用的洗脫劑容易對產(chǎn)品造成二次污染，難以進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)[12]；分子蒸餾難以分離相對分子質(zhì)量相近的脂肪酸，設(shè)備要求較高，應(yīng)用具有一定的局限性，不適合工業(yè)生產(chǎn)[13-14]；超臨界流體萃取法無法分離碳數(shù)相近的脂肪酸，且設(shè)備昂貴，成本較高[15]。

β-環(huán)糊精法采用內(nèi)疏水、外親水的β-環(huán)糊精對油脂進(jìn)行包合，可利用其內(nèi)部疏水親脂作用與疏水性分子通過非共價(jià)鍵作用形成穩(wěn)定包合物，而α-亞麻酸的結(jié)構(gòu)式存在3個(gè)共軛雙鍵形成一種類似芳香環(huán)狀結(jié)構(gòu), β-環(huán)糊精的空腔中的羥基容易和芳香環(huán)結(jié)構(gòu)形成新的氫鍵，因此β-環(huán)糊精更容易與α-亞麻酸包合[16]。β-環(huán)糊精屬于天然產(chǎn)品，無毒無害，且操作簡單，因此適合推廣到工業(yè)生產(chǎn)中[17]。超聲波輔助提取的原理主要是依據(jù)超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化作用和熱效應(yīng)，通過提高物質(zhì)的分子運(yùn)動(dòng)速度，增大介質(zhì)分子的穿透率，對活性物質(zhì)進(jìn)行提取[18，19]。利用超聲波在液體中傳播時(shí)產(chǎn)生的沖擊波，釋放能量，有利于環(huán)糊精與油脂包合過程的進(jìn)行[20]，并且超聲波輔助在提取熱敏性物質(zhì)和要求低溫加工的食品方面應(yīng)用較為廣泛。α-亞麻酸具有熱不穩(wěn)定性，容易氧化變質(zhì)，因此，選取超聲代替普通機(jī)械攪拌輔助β-環(huán)糊精法對紫蘇籽油α-亞麻酸進(jìn)行提取，對α-亞麻酸破壞較少，更有利于包合，相對于微波輔助提取成本更低。

目前使用β-環(huán)糊精法提取α-亞麻酸的研究較少，利用其對紫蘇籽油中的α-亞麻酸進(jìn)行提取的更是少見。本研究通過超聲輔助β-環(huán)糊精法對紫蘇籽油中的α-亞麻酸進(jìn)行提取，采用響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件，為α-亞麻酸的提取及紫蘇籽油的開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽油 自購，經(jīng)物理低溫壓榨法制成。

α-亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、石油醚、β-環(huán)糊精、BF3-甲醇(55%～60%)、NaOH、鹽酸、無水乙醇、NaCl、無水硫酸鈉(均為分析純)、正己烷(色譜純)。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；DH-101-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器；EKQ-700E型數(shù)控超聲波清洗器；BSA224S電子天平；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；GC1120氣相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸組成的測定

取0.1 g樣品和5.6 mL 10%BF3-甲醇溶液置圓底燒瓶混勻后65 ℃磁力攪拌3 min，冷卻；加入5 mL正己烷磁力攪拌3 min；繼續(xù)加入5 mL飽和NaCl溶液，晃動(dòng)燒瓶數(shù)分鐘后轉(zhuǎn)移至試管，靜置分層后取上層溶液適量加入無水硫酸鈉去除痕量水分，得到的甲酯化樣品即可備氣相色譜分析用。

氣相色譜條件：色譜柱：鍵合交聯(lián)聚乙二醇固定相，柱長30 m。柱溫箱溫度：起始溫度150 ℃，以10℃/min升溫至200 ℃，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持15 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣量1 μL，分流比20∶1；FID檢測器溫度：270 ℃；載氣：高純氮?dú)猓髁浚?.0 mL/min，尾吹：25 mL/min；氫氣：40mL/min；空氣：450 mL/min。

1.3.2 原料預(yù)處理

稱取5 g紫蘇籽油，加入20 mL5% NaOH乙醇溶液，混勻后充分皂化；適量水溶解皂化液后石油醚萃取3次，調(diào)節(jié)pH值至2～3左右，隨后取油層用純水沖洗至中性；干燥1 h后，即得紫蘇籽油混合脂肪酸。

稱取22.25 g β-環(huán)糊精4份，50 ℃水溶解，制成飽和溶液。精確稱取1 g紫蘇籽油和0.5 g無水乙醇(質(zhì)量比2∶1)、1 g紫蘇籽油混合脂肪酸(FFA)和0.5 g無水乙醇、1 g紫蘇籽油、1 g紫蘇籽油FFA，混合均勻后分別加入β-環(huán)糊精過飽和溶液中，攪拌均勻后放置超聲波振蕩器中，50 ℃條件下超聲50 min，每10 min取出磁力攪拌30 s；待冷卻后，放置冰箱(-18 ℃)冷凍20 h后進(jìn)行脫包合。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 料液比的選擇

稱取15、18.75、22.25、26.25、30 g β-環(huán)糊精，50 ℃水溶解，制成飽和溶液。精確稱取1 g紫蘇籽油和0.5 g無水乙醇(質(zhì)量比2∶1)，混合均勻后加入β-環(huán)糊精過飽和溶液中(即為料液比10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1、20∶1)，攪拌均勻后放置超聲波振蕩器中，50 ℃條件下超聲70 min，每10 min取出磁力攪拌30 s；待冷卻后，放置冰箱(-18 ℃)冷凍20 h后進(jìn)行脫包合。

1.3.3.2 超聲時(shí)間的選擇

稱取22.25 g β-環(huán)糊精，50 ℃水溶解，制成飽和溶液。精確稱取1 g紫蘇籽油和0.5 g無水乙醇(質(zhì)量比2∶1)，混合均勻后加入β-環(huán)糊精過飽和溶液中，攪拌均勻后放置超聲波振蕩器中，50 ℃條件下超聲40、50、60、70、80 min，每10 min取出磁力攪拌30 s；待冷卻后，放置冰箱(-18 ℃)冷凍20 h后進(jìn)行脫包合。

1.3.3.3 超聲溫度的選擇

稱取22.25 g β-環(huán)糊精，50 ℃水溶解，制成飽和溶液。精確稱取1 g紫蘇籽油和0.5 g無水乙醇(質(zhì)量比2∶1)，混合均勻后加入β-環(huán)糊精過飽和溶液中，攪拌均勻后放置超聲波振蕩器中，于30、40、50、60、70 ℃條件下超聲70 min，每10 min取出磁力攪拌30 s；待冷卻后，放置冰箱(-18 ℃)冷凍20 h后進(jìn)行脫包合。

1.3.4 脫包合過程

待凍干物融化后抽濾得白色固體，用無水乙醇20 mL洗滌2次，放入恒溫鼓風(fēng)干燥器中，經(jīng)2 h恒溫干燥(60 ℃)后，得到的白色粉末，即為β-環(huán)糊精-紫蘇籽油復(fù)合物；將復(fù)合物轉(zhuǎn)移至燒杯，加入50 mL石油醚，60 ℃磁力攪拌1 h后減壓抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(55 ℃)勻速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收石油醚，待回收完全后，剩余液體即為α-亞麻酸含量豐富的脂肪酸，用于檢測提取后的α-亞麻酸純度。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取Box-Behnken模型試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度為3個(gè)考察因素，分別以A、B、C表示，各因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以-1、0、1對自變量的實(shí)驗(yàn)水平編碼，共17組實(shí)驗(yàn)，其中12組為析因點(diǎn)；5組為區(qū)域的中心零點(diǎn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 原料預(yù)處理

難溶或者微溶于水的物質(zhì)需要借助乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑才能溶解，從而更容易形成包合物[21]，而α-亞麻酸可溶于乙醇，因此可將原料加入乙醇充分混合后再加入環(huán)糊精包合溶液進(jìn)行包合[22]。在超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間70 min條件下，分別稱取1 g紫蘇籽油FFA、1 g紫蘇籽油FFA和0.5 g無水乙醇(質(zhì)量比2∶1)、1 g紫蘇籽油、1 g紫蘇籽油和0.5 g無水乙醇為原料，料液比為15∶1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖1可知，當(dāng)原料為混合脂肪酸和無水乙醇混合物、紫蘇籽油與無水乙醇的混合物時(shí)，α-亞麻酸純度相對較高，分別為73.17%和73.67%，且紫蘇籽油無需皂化、中和處理，工藝更加簡單，因此采用在紫蘇籽油中加入無水乙醇(紫蘇籽油∶無水乙醇=2∶1)的方式對原材料進(jìn)行預(yù)處理。

注：FFA指經(jīng)皂化、中和處理后所得紫蘇籽油混合脂肪酸。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對產(chǎn)物影響

在超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間70 min條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由圖2可見，當(dāng)料液比在10 ∶1～15∶1時(shí)，隨著β-環(huán)糊精用量的增加，紫蘇籽油中α-亞麻酸的提取率也逐漸升高。當(dāng)料液比在15∶1時(shí)，紫蘇籽油包合完全，達(dá)到α-亞麻酸最大純度73.67%。當(dāng)β-環(huán)糊精質(zhì)量繼續(xù)增加時(shí)，α-亞麻酸純度開始降低，可能是紫蘇籽油包合完全后，再增加β-環(huán)糊精用量，會促使對混合溶液中未知雜質(zhì)的包合，不僅增加了物料和成本的消耗，還降低了產(chǎn)物的純度。

2.2.2 超聲時(shí)間對產(chǎn)物影響

在超聲溫度50 ℃，料液比15∶1條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由圖2可見，超聲波時(shí)間在50～70 min時(shí)，α-亞麻酸純度不斷增加，也即進(jìn)入β-環(huán)糊精中空腔體的脂肪酸逐步遞增，70 min時(shí)，達(dá)到73.67%。80 min時(shí)α-亞麻酸純度開始降低，說明在包合完全后，如果繼續(xù)用超聲波振蕩，會導(dǎo)致脫包效應(yīng)的產(chǎn)生，已被包合的紫蘇籽油會被振蕩出β-環(huán)糊精的中空腔體。

2.2.3 超聲溫度對產(chǎn)物影響

在超聲時(shí)間70 min，料液比15∶1條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由圖2可見，α-亞麻酸純度有先增后減再增加的趨勢，但在趨勢變化上，α-亞麻酸純度增加趨勢沒有開始趨勢顯著，即在50 ℃條件下，達(dá)到α-亞麻酸最大純度73.67%，60 ℃后，紫蘇籽油無水乙醇混合液中的無水乙醇揮發(fā)量增加，溶解量下降，影響了包合物的形成，導(dǎo)致α-亞麻酸純度明顯下降。

圖2 料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度對紫蘇籽油α-亞麻酸純度的影響

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 回歸方程的建立與分析

根據(jù)Box-Behnken模型所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方案進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

續(xù)表2

利用Design-Expert8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，建立α-亞麻酸純度(Y)的回歸模型，擬合二次多項(xiàng)式方程如下：

Y=72.81+0.69A-0.96B+0.89C+1.34AB-0.48AC-0.35BC-1.67A2-2.70B2-2.07C2

各個(gè)因素的F值反映了此因素對試驗(yàn)指標(biāo)的重要程度，通過表3能夠得出，α-亞麻酸純度受3個(gè)因素的影響依次為B>C>A，即超聲時(shí)間>液料比>超聲溫度。模型二次項(xiàng)B2、C2均對響應(yīng)值α-亞麻酸純度影響極顯著(P<0.01)；一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)A2、AB交互作用顯著(P<0.05)；其余項(xiàng)對α-亞麻酸純度不顯著。剔除二次多項(xiàng)式中的不顯著項(xiàng)，將擬合方程修正為：Y=72.81-0.96B+1.34AB-1.67A2-2.70B2-2.07C2。

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面分析

圖3為各因素交互作用對α-亞麻酸純度影響的響應(yīng)面與等高線圖。由圖3a可知，在液料比為15∶1的條件下，超聲溫度與超聲時(shí)間的交互作用較弱。當(dāng)固定超聲溫度時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，α-亞麻酸純度增大，但達(dá)到峰值后又呈下降趨勢。圖3b顯示，在超聲時(shí)間為70 min條件下，超聲溫度與液料比交互作用顯著，在液料比較小時(shí)，α-亞麻酸純度隨超聲溫度的增加而增加，達(dá)到峰值逐漸下降。由圖3c可知，在超聲溫度為50 ℃時(shí)，超聲時(shí)間和液料比的交互作用較弱。說明超聲時(shí)間對α-亞麻酸純度的影響與液料比的關(guān)系較小。

圖3 各因素交互作用對α-亞麻酸純度影響的響應(yīng)面與等高線圖

通過Design-Expert 8.0.6軟件，并結(jié)合回歸模型和響應(yīng)面圖分析得出提取紫蘇籽油α-亞麻酸的最佳條件為：超聲溫度51.12 ℃、超聲時(shí)間68.37 min、液料比15.54∶1。在此條件下，預(yù)測α-亞麻酸純度為73.02%。

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析所得最佳參數(shù)，綜合考慮實(shí)際情況，將工藝條件調(diào)整為超聲溫度51 ℃、超聲時(shí)間68 min、液料比15∶1，在此條件下重復(fù)3次，測得α-亞麻酸純度的平均值為72.93%，與模型預(yù)測值基本相符，證明此模型有效可靠。

3 結(jié)論

以紫蘇籽油為原料，在β-環(huán)糊精包合α-亞麻酸過程中，用超聲波振蕩取代普通的機(jī)械攪拌，雖然應(yīng)用于工業(yè)化會有一定的局限性，但是利用超聲波釋放能量，更有利于包合物的形成，具有更廣闊的發(fā)展前景，并且用紫蘇籽油和無水乙醇直接進(jìn)行環(huán)糊精包合，無需皂化處理，工藝簡單。實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken模型響應(yīng)面分析優(yōu)化，對提取紫蘇籽油中α-亞麻酸的工藝條件進(jìn)行研究，得出了紫蘇籽油中α-亞麻酸提取的最佳工藝條件為：超聲溫度51 ℃、超聲時(shí)間68 min、液料比15∶1。本研究獲得了一種α-亞麻酸優(yōu)化工藝，最優(yōu)條件下α-亞麻酸純度可達(dá)到72.93%，可為后續(xù)α-亞麻酸進(jìn)一步純化以及α-亞麻酸功能產(chǎn)品的開發(fā)提供思考。