小兒寶泰康顆粒對流感病毒感染細(xì)胞的抗病毒作用研究

劉軍 陳田 湯記路 劉媛媛 楊占秋

摘要 目的：觀察小兒寶泰康顆粒對流感病毒感染細(xì)胞的抑制作用。方法：通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)觀察不同濃度的小兒寶泰康顆粒對Madin-Darby犬腎（MDCK）細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，采用MTT法并結(jié)合CPE法檢測細(xì)胞成活率和病毒抑制率，計算藥物的抗病毒指數(shù)TI，以利巴韋林作為陽性對照藥物，評價該藥物對甲、乙型流感病毒的抗病毒活性。結(jié)果：小兒寶泰康顆粒對MDCK細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（CC50）為5.6 mg/mL，對甲型H1N1流感病毒感染MDCK細(xì)胞的半數(shù)有效濃度（EC50）為2.1 mg/mL，而對乙型流感病毒的EC50為1.44 mg/mL，抗病毒指數(shù)分別為2.64和3.89。在陽性對照藥物實(shí)驗(yàn)中，利巴韋林在200 μg/mL時，對甲、乙型流感病毒的抑制率均達(dá)到70%以上。結(jié)論：小兒寶泰康顆粒是一種對不同型流感病毒感染有抗病毒作用的藥物，有臨床應(yīng)用前景和進(jìn)一步研究的價值。

關(guān)鍵詞 小兒寶泰康顆粒;流感病毒;MTT法;CPE法;抗病毒指數(shù);細(xì)胞實(shí)驗(yàn);病毒抑制率;細(xì)胞毒性;半數(shù)有效濃度

Study on Antiviral Activity of Xiao′er Baotaikang Granuels Against Influenza Virus in Vitro

LIU Jun1，CHEN Tian2，TANG Jilu1，LIU Yuanyuan 1，YANG Zhanqiu1

（1 Institute of Medical Virology，School of Basic Medicine，Wuhan University，Wuhan 430071，China; 2 Department of Clinical Lab，Hubei Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Wuhan 430015，China）

Abstract Objective：To investigate the antiviral activity of Xiao′er Baotaikang Granuels on influenza virus in vitro.Methods：We observed the cytotoxic effect of different concentrations of Xiaoer Baotaikang Granules on Madin-Darby canine kidney（MDCK） cells by cell culture technology，used MTT method combined with CPE method to detect cell survival rate and virus inhibition rate，calculated the drug′s antiviral index TI，and used ribavirin as positive control drug to evaluate the antiviral activity of the drug against influenza A and B viruses.Results：The 50% cytotoxic concentration （CC50） of Xiaoer Baotaikang Granules on MDCK cells was 5.6 mg/mL，and the 50% effective concentration （EC50） for MDCK cells infected by influenza A H1N1 virus was 2.1 mg/mL，while for influenza B viruses The EC50 was 1.44 mg/mL，and the antiviral indexes were 2.64 and 3.89，respectively.In the positive control drug experiment，when ribavirin was 200 μg/mL，the inhibition rate of influenza A and B viruses reached more than 70%.Conclusion：Xiaoer Baotaikang Granules are a kind of antiviral drugs that have antiviral effects on different types of influenza virus infections.It has clinical application prospects and further research value.

Keywords Xiaoer Baotaikang Granules; Influenza virus; MTT method; Cytopathologic effect assay; Antiviral index; Cell experiment; Inhibition rate;Cytotoxicity; 50% effective concentration

中圖分類號：R254.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.018

在以發(fā)熱為主要癥狀的呼吸道感染疾病中，流感病毒仍是最為常見的致病病原體[1]。由于流感病毒易發(fā)生變異，常出現(xiàn)新亞型病毒株傳播流行。因此，人類尚不能完全控制流感病毒引起的病毒性傳染病，歷史上曾數(shù)次出現(xiàn)世界性大流行。如2009年底在美國和全球范圍內(nèi)爆發(fā)的新型甲型H1N1流感，當(dāng)時無有效疫苗進(jìn)行預(yù)防和控制其傳播而造成大流行;而目前全球每年有近500萬人感染流感病毒，其中至少有25～50萬人死亡[2-3]。流感病毒（Influenza Virus）屬于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）成員，根據(jù)病毒的宿主類型，分為人流感病毒、禽流感病毒和動物流感病毒。根據(jù)病毒的生物學(xué)特征，人流感病毒又分為甲（A）、乙（B）和丙（C）型以及近期報道的?。―）型流感病毒[4]。甲型流感病毒因抗原性易發(fā)生變異，血凝素（HA）基因變異最為常見，并出現(xiàn)很多新的亞型，其中以甲型H1N1流感病毒多見[5]。乙型流感病毒僅在人群中局部傳播流行，不引起世界性大流行。丙型流感病毒只引起輕微的上呼吸道感染，也很少引起流行[2，6]。由于化學(xué)合成藥物易出現(xiàn)毒性和耐藥性，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限。如金剛烷胺及其衍生物不僅存在神經(jīng)毒性，且易產(chǎn)生耐藥毒株，對B型流感病毒感染基本無效補(bǔ)充參考文獻(xiàn);利巴韋林治療流感可出現(xiàn)骨髓毒性，對其療效爭議較多;奧司他韋是WHO推薦治療甲型H1N1流感病毒感染的藥物，但由于其不良反應(yīng)、耐藥株逐年增多，有的國家已限制將其用于青少年流感病毒感染的治療[7]。因此，需要尋找新的抗流感病毒藥物用于臨床。

中草藥在流感病毒感染的治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢，諸多文獻(xiàn)報道了中藥在流感病毒感染中的臨床應(yīng)用及藥物抗病毒活性成分的現(xiàn)代研究，如板藍(lán)根沖劑，其具有清熱解毒和抗菌消炎等作用[8-9]。近年來也有較多中藥抗病毒機(jī)制研究的報道，如Yan等[10]報道薊黃素（Cirsimaritin）有抑制多種甲型流感病毒株的作用，并通過抑制細(xì)胞因子的表達(dá)而發(fā)揮抗病毒作用。鑒于中藥在治療流感病毒感染中的優(yōu)勢，為了尋找更多適用于抗流感病毒且不良反應(yīng)少、未產(chǎn)生耐藥性的藥物，我們觀察了小兒寶泰康顆粒在細(xì)胞培養(yǎng)中對甲、乙型流感病毒的抗病毒作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 MDCK細(xì)胞為中國科學(xué)院武漢病毒所王薇副研究員贈送。

1.1.2 病毒 流感病毒A/FM/1/47（H1N1），由中國預(yù)防科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供，乙型流感病毒為本室保存。使用前2種病毒用9～11日齡雞胚，經(jīng)過尿囊腔接種增殖病毒，收集尿囊液，以1 500×g離心15 min，收上清液后，用血凝實(shí)驗(yàn)檢測病毒血凝滴度，當(dāng)血凝滴度≥1∶640，過濾除菌，分裝備用。

1.1.3 藥物 小兒寶泰康顆粒（健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：210341）;陽性對照藥物利巴韋林（天津藥業(yè)有限公司，批號：0203071）。

1.1.4 主要試劑與儀器 細(xì)胞生長液為RPMI640（GIBICO公司，美國，批號：12800-017），加10%小牛血清（GIBICO公司，美國，批號;10099-141），100 U/mL青霉素（Invitrogin公司，美國，批號：15070063），100 μg/mL鏈霉素（Invitrogin公司，美國，批號：15070063）。細(xì)胞維持液除新生小牛血清為2%外，其余同細(xì)胞生長液。MTT（4，5二甲基噻唑-2，5-二苯基四唑溴化物）（SIGMA公司，日本，批號：57360-96-7）;DMEM（GIBICO公司，美國，批號：12800-017，31330-038）;胎牛血清（GIBICO公司產(chǎn)品，美國，批號：10099-141）;二甲基亞砜（DMSO）（上海菲達(dá)有限公司，批號：67-68-5）;Forma Scientific生物安全工作臺（Forma公司，美國，型號：1160E型）;OLYMPUS倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號：IMT-413型）;自動酶聯(lián)免疫檢測儀（Rayto公司，美國，型號：RT-2100C型;二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國，型號：Series Ⅱ）。

1.2 方法

1.2.1 小兒寶泰康顆粒的配制與實(shí)驗(yàn)分組 稱取小兒寶泰康顆粒100 mg，加入蒸餾水溶解，定容至10 mL，8磅高壓滅菌15 min備用。臨用時用細(xì)胞維持培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。陽性對照藥物利巴韋林用生理鹽水無菌稀釋至0.1 g/mL備用。

本實(shí)驗(yàn)分2個部分，首先觀察小兒寶泰康顆粒的細(xì)胞毒性，然后在半數(shù)細(xì)胞毒性范圍內(nèi)，觀察小兒寶泰康顆的抗流感病毒效果。

1.2.2 小兒寶泰康顆粒對Madin-Darby犬腎（MDCK）細(xì)胞的毒性作用觀察 用胰蛋白酶將生長良好的MDCK細(xì)胞分散成單個細(xì)胞懸液，在96孔板上，每孔加入0.1 mL 5×106濃度的MDCK細(xì)胞，待24 h細(xì)胞長成單層后，加入10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.313 mg/mL、0.156 mg/mL等7個不同濃度的含藥維持液，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。每一藥物濃度均重復(fù)4孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。觀察藥物的細(xì)胞毒性。

1.2.3 小兒寶泰康顆的抗流感病毒作用觀察 于已長成單層MDCK細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板上，每孔接種50 μL的100TCID50的流感病毒液，分別于33 ℃吸附90 min，棄病毒上清。根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在小兒寶泰康顆粒半數(shù)細(xì)胞毒性濃度范圍內(nèi)，加入不同濃度的含小兒寶泰康顆粒的細(xì)胞維持液，每孔0.2 mL，濃度分別為5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.312 5 mg/mL、0.156 25 mg/mL、0.078 125 mg/mL，分別置33 ℃，5% CO2培養(yǎng)，每日觀察。隔天換新鮮含藥維持液。每種濃度重復(fù)4孔。同時設(shè)正常細(xì)胞對照組、病毒對照組、陽性藥物對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。觀察藥物的抗病毒作用。

1.2.4 小兒寶泰康顆粒對流感病毒感染細(xì)胞內(nèi)HA的抑制作用 按抗流感病毒實(shí)驗(yàn)，待流感病毒吸附MDCK細(xì)胞90 min后，將不同濃度小兒寶泰康顆粒加入到96孔細(xì)胞板內(nèi)200 μL/孔，置35 ℃ CO2孵箱中培養(yǎng)，72 h后收集各實(shí)驗(yàn)孔病毒上清進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞內(nèi)HA的表達(dá)情況。

1.2.5 小兒寶泰康顆粒的半數(shù)細(xì)胞毒性（CC50）檢測 以細(xì)胞成活率作為藥物的細(xì)胞毒性評價指標(biāo)。藥物作用細(xì)胞48 h后，MTT法檢測細(xì)胞成活率。MTT法參照文獻(xiàn)加以改進(jìn)[11-12]，檢測小兒寶泰康顆粒對MDCK細(xì)胞毒性作用。上述小兒寶泰康顆粒處理的培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液上清，每孔加入含5 mg/mL MTT的PBS溶液50 μL，置37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h后，棄上清，每孔加DMSO溶解液100 μL，振蕩5～10 min，待結(jié)晶完全溶解，置酶標(biāo)測定儀上，測定570 nm波長處的光密度OD值，并根據(jù)下式計算細(xì)胞成活率和藥物半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（CC50）。

細(xì)胞成活率（%）=藥物處理組平均OD570細(xì)胞對照組平均OD570×100%

1.2.6 小兒寶泰康顆粒的抗流感病毒效果測定指標(biāo)與方法 以病毒抑制率和病毒血凝素（HA）抑制率為指標(biāo)評價藥物的抗流感病毒效果，前者以病毒抗原OD值變化為指標(biāo)，后者以病毒HA抗原變化為指標(biāo)。參考文獻(xiàn)檢測小兒寶泰康顆粒對流感病毒的抑制率[12，14]。在上述（1.2.3）藥物處理的病毒感染細(xì)胞120 h后，每孔加入含5 mg/mL MTT的培養(yǎng)液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h后，洗去MTT上清，加DMSO溶解液每孔100 μL，混勻，5 min后，用酶標(biāo)儀測570 nm波長處的光密度OD值。并按下述公式計算小兒寶泰康顆粒對流感病毒的抑制率。

病毒抑制率（%）=藥物處理組OD570-病毒對照組OD570細(xì)胞對照組OD570-病毒對照組OD570×100%

病毒HA檢測參考文獻(xiàn)[14]，在上述（1.2.4）藥物處理的病毒感染細(xì)胞72 h后，用96孔血凝板，除第一孔外，每孔加入25 μL生理鹽水。第一孔加50 μL待測病毒懸液，取25 μL做2倍系列稀釋，最后一孔棄去25 μL。每孔加入25 μL1%雞紅細(xì)胞懸液，使紅細(xì)胞與病毒充分混合，室溫靜置30 min，45 min，60 min時，觀察血凝現(xiàn)象并記錄結(jié)果。以靜置45 min時的血凝現(xiàn)象為最終結(jié)果。以出現(xiàn)“++”（即紅細(xì)胞在孔底形成一個環(huán)狀，四周有小凝集塊）的流感病毒最高稀釋度為血凝終點(diǎn)，該稀釋度的倒數(shù)即為流感病毒的血凝滴度。實(shí)驗(yàn)同時設(shè)生理鹽水對照（排除血細(xì)胞自身的非特異性凝集）和病毒對照。并按下式計算病毒血凝素（HA）抑制率。

病毒HA抑制率=病毒對照組血凝滴度-實(shí)驗(yàn)孔血凝滴度病毒對照組血凝滴度×100%

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示。多組數(shù)據(jù)間的對比用one-way ANOVA進(jìn)行分析比較，細(xì)胞成活率和病毒抑制率與藥物濃度之間的關(guān)系用Probit回歸進(jìn)行分析，計算小兒寶泰康顆粒半數(shù)毒性濃度（CC50）和半數(shù)有效濃度（EC50），得到小兒寶泰康顆粒抗病毒指數(shù)（Treatment Index，TI=CC50/EC50）。

2 結(jié)果

2.1 小兒寶泰康顆粒對MDCK細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度測定 小兒寶泰康顆粒從10 mg/mL稀釋至0.157 mg/mL等7個濃度時，細(xì)胞成活率從25.8%提高到97.5%，細(xì)胞成活率與藥物濃度呈反向梯度關(guān)系，未用小兒寶泰康顆粒處理的正常細(xì)胞成活率為100%，OD值為0.894。用probit回歸統(tǒng)計分析，測得小兒寶泰康顆粒對MDCK細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（CC50）為5.6 mg/mL。見表1。

2.2 小兒寶泰康顆粒對甲、乙型流感病毒感染細(xì)胞的抗病毒作用 在半數(shù)細(xì)胞毒性濃度范圍內(nèi)，病毒的抑制率與小兒寶泰康顆粒濃度呈正相量效關(guān)系，在2.5 mg/mL時，甲型流感病毒的抑制率為62.9%，當(dāng)濃度低至0.078 mg/mL時，未顯示出抗病毒作用。見表2。小兒寶泰康顆粒對甲型流感病毒的EC50為2.12 mg/mL。以2.0 mg/mL稀釋至0.063 mg/mL等6個濃度抗病毒活性，呈現(xiàn)出與甲型流感病毒同樣的結(jié)果。見表3。在2.0 mg/mL時，乙型流感病毒的抑制率達(dá)到85%，EC50為1.44 mg/mL。小兒寶泰康顆粒對2種病毒的抗病毒指數(shù)分別為2.64和3.89（P<0.05）。病毒HA抗原的抑制率與小兒寶泰康顆粒濃度呈正相量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在陽性對照藥物實(shí)驗(yàn)中，利巴韋林濃度為0.2 mg/mL時，對甲、乙型流感病毒的抑制率均達(dá)到70%以上。見表2～3。

3 討論

由于流感病毒感染普遍存在且無有效的預(yù)防措施，抗流感病毒等呼吸道病毒感染藥物一直是研究熱點(diǎn)，諸多新制劑也運(yùn)用于抗病毒研究[13-14]。這些抗流感病毒制劑有化學(xué)合成藥物、抗體藥物和天然植物藥物[15-17]，近年來也有報道稱納米藥物可能通過影響病毒進(jìn)入細(xì)胞從而預(yù)防流感病毒感染的報道，但尚處于初步研究階段[18-19]。我們過去也發(fā)現(xiàn)阿比朵爾和歐意清熱解毒軟膠囊有抗甲型H1N1流感病毒作用，并已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段[20-21]。解秀文和郭春艷[22]也報道小兒寶泰康顆粒治療小兒急性上呼吸道感染有較好的臨床治療效果，但是否對流感病毒有抗病毒作用尚無定論。

小兒寶泰康顆粒是由連翹、地黃、滇柴胡、玄參和桑葉等12味中藥組成的復(fù)方中成藥制劑，由健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，它具有解表清熱、止咳化痰作用，臨床上廣泛用于小兒風(fēng)熱外感，癥見發(fā)熱、流涕、咳嗽、脈浮等的治療，效果較好。有報道處方中的連翹、地黃、玄參和南板藍(lán)根具有抗流感病毒作用，小兒寶泰康顆粒對金黃色萄球菌、肺炎球菌等有抗菌作用，但是對流感病毒感染有無抗病毒作用尚未見報道[8，23]。為了確定小兒寶泰康顆粒的抗流感病毒效果，我們利用流感病毒敏感的MDCK細(xì)胞株進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察了該藥對甲、乙型流感病毒的抗病毒作用。

MDCK細(xì)胞（狗腎細(xì)胞株）是一種對不同流感病毒敏感的細(xì)胞系，能支持不同型流感病毒復(fù)制增殖，是體外評價抗流感病毒的模型系統(tǒng)。為此，我們首先觀察了小兒寶泰康顆粒對MDCK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，發(fā)現(xiàn)小兒寶泰康顆粒對MDCK細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度為5.6 mg/mL，說明該藥細(xì)胞毒濃度較高，安全性大。根據(jù)病毒進(jìn)入細(xì)胞的復(fù)制機(jī)制，參考Dou等[23]研究報道，本實(shí)驗(yàn)以該藥半數(shù)細(xì)胞毒性濃度為依據(jù)，以利巴韋林作為陽性藥物對照，觀察了小兒寶泰康顆粒6個不同稀釋度時在MDCK細(xì)胞內(nèi)的抗流感病毒活性，結(jié)果顯示小兒寶泰康顆粒對甲、乙型流感病毒感染的MDCK細(xì)胞均有抗病毒活性，表現(xiàn)為病毒抑制率和病毒HA抗原抑制率隨著藥物濃度增加而增加，顯示出明顯的量效關(guān)系。當(dāng)小兒寶泰康顆粒的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（TC50）為5.6 mg/mL時，對甲、乙型流感病毒的半數(shù)有效濃度分別為2.12 mg/mL和1.44 mg/mL。這些結(jié)果證明了小兒寶泰康顆粒在細(xì)胞內(nèi)有抗流感病毒作用且安全性高，同時驗(yàn)證了小兒寶泰康顆粒治療兒童急性上呼吸道感染有較好治療效果的結(jié)論[22]。

本研究結(jié)果也顯示小兒寶泰康顆粒對甲、乙型流感病毒的抗病毒指數(shù)不同，分別為2.64和3.89，這可能是因?yàn)榧仔土鞲胁《疽装l(fā)生變異，變異后病毒的生物學(xué)特征發(fā)生改變，故對藥物的敏感性不同所致。此外，陽性對照藥物利巴韋林與小兒寶泰康顆粒顯示對病毒的抑制作用濃度亦不同，這是由于利巴韋林為化學(xué)合成藥物，成分單一，結(jié)構(gòu)清楚，而小兒寶泰康顆粒是由多種中草藥組成的復(fù)方制劑，藥物的顯效成分和結(jié)構(gòu)不同，故起效濃度不同，但是以它作為參照證明了小兒寶泰康顆粒的抗流感病毒作用。小兒寶泰康顆粒的抗病毒有效成分和結(jié)構(gòu)特征與抗病毒活性的關(guān)系仍有待深入研究。

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（2021-09-05收稿 責(zé)任編輯：吳珊）