基于網(wǎng)絡藥理學探討黃芪治療病毒性心肌炎的作用機制

陳品良 陳漢裕 陳梓欣 冼紹祥

摘要 目的：基于網(wǎng)絡藥理學對黃芪治療病毒性心肌炎（VMC）的作用機制進行探討。方法：在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）獲取并篩選黃芪活性成分，獲得對應的靶蛋白，并用Uniprot數(shù)據(jù)庫將蛋白名稱校正為基因符號，通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫篩選出VMC的相關基因，將黃芪的靶基因與VMC相關基因取交集獲得黃芪治療VMC的靶基因，使用Cytoscape 3.8.0構建“黃芪-活性成分-靶基因-VMC”網(wǎng)絡，在STRING數(shù)據(jù)庫下載PPI數(shù)據(jù)并利用R 4.0.0篩選出核心靶基因，利用R 4.0.0對黃芪治療VMC的靶基因進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。結果：共獲得黃芪活性成分20個，靶基因191個，VMC相關基因192個，取交集獲得黃芪治療VMC的靶基因34個，構建“黃芪-活性成分-靶基因-VMC”網(wǎng)絡，VEGFA、AKT1、IL10、IL6、MMP9、TNF等可能是黃芪治療VMC的核心靶基因。GO富集主要集中于細胞因子受體結合、細胞黏附的調節(jié)、對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、細胞因子活性等方面。KEGG通路富集在AGE-RAGE信號通路（糖尿病并發(fā)癥中）、IL17信號通路、乙型肝炎通路、甲型流感通路、查加斯病通路等。結論：本研究初步揭示了黃芪治療VMC的核心靶基因和涉及的生物學過程及信號通路，為后續(xù)深入研究提供一定參考。

關鍵詞 黃芪;病毒性心肌炎;靶基因;網(wǎng)絡藥理學;作用機制;活性成分;基因本體富集;京都基因和基因組百科全書通路富集

Investigation of Mechanisms of Radix Astragali seu Hedysari in the Treatment of Viral Myocarditis Based on a Network Pharmacology Approach

CHEN Pinliang1，CHEN Hanyu2，CHEN Zixin2，XIAN Shaoxiang2

（1 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 2 The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

Abstract Objective：To investigate the mechanisms of Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of viral myocarditis （VMC） based on a network pharmacology approach.Methods：Radix Astragali seu Hedysari′active ingredients were obtained from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）.The corresponding target proteins of active ingredients were obtained from TCMSP，and the protein names were corrected to gene symbols by using UniProt database.We obtained the related genes of VMC in GeneCards and OMIM database.The target genes of Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of VMC were obtained by the intersection of the target genes of Radix Astragali seu Hedysari and the related genes of VMC.Using Cytoscape 3.8.0“Radix Astragali seu Hedysari-Active ingredient-Target gene-VMC” network was constructed.The PPI data were downloaded from STRING database and the core target genes were obtained through screening in R 4.0.0.R 4.0.0 was used to perform Go and KEGG pathway enrichment analysis on the target genes of Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of VMC.Results：A total of 20 active ingredients and 191 target genes of Radix Astragali seu Hedysari were obtained while 192 related genes of VMC were obtained.A total of 34 target genes of Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of VMC were obtained by intersection.The“Radix Astragali seu Hedysari-Active ingredient-Target gene-VMC” network was constructed.VEGFA，AKT1，IL10，IL6，MMP9，TNF，etc.may be the core target genes for Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of VMC.The enrichment of GO is mainly concentrated in the cytokine receptor binding，regulation of cell-cell adhesion，response to lipopolysaccharide，response to molecule of bacterial origin，cytokine activity，etc..The enrichment of KEGG pathway was mainly concentrated in the AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，IL-17 signaling pathway，Hepatitis B，Influenza A，Chagas disease （American trypanosomiasis），etc.Conclusion：This study preliminarily reveals the core target genes，biological process and signal pathway of Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of VMC，which provides reference for further research.

Keywords Radix Astragali seu Hedysari; Viral myocarditis; Target gene;Network pharmacology; Mechanism; Active ingredient; GO enrichment; KEGG pathway enrichment

中圖分類號：R289.5;R735.7;R541文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.015

病毒性心肌炎（Viral Myocarditis，VMC）是由病毒感染所致的彌漫性或局限性心肌炎癥性疾病，以兒童和40歲以下的成年人居多，大多數(shù)患者可自愈，但其中一些可以遷延并發(fā)生各種心律失常，還有一些可以急性發(fā)作，導致心力衰竭，甚至猝死。目前VMC無特異性治療，主要是給予抗病毒、促心肌代謝、生命支持及對癥治療等處理，但存在治療時間長、效果欠佳、易反復等不足。

中醫(yī)臨床常常重用黃芪參與治療VMC，以湯劑或成藥（如黃芪顆粒、黃芪口服液等）口服，或制成針劑，療效顯著，也有不少相關文獻報道，但其作用機制尚未完全闡明。鑒于中藥具有多成分、多靶點等特點，本研究基于網(wǎng)絡藥理學的相關原理及研究方法，分析黃芪治療VMC的活性成分、靶基因及相關信號通路，探討其中可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 獲取并篩選黃芪活性成分，獲得對應的靶基因

采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），檢索“黃芪”，篩選條件設置為：口服生物利用度（OB）>30%，類藥性（DL）>0.18，獲得黃芪活性成分及對應的靶蛋白;考慮到該平臺對蛋白質命名不規(guī)范，于是使用UniProt數(shù)據(jù)庫，以“Human”“Reviewed”作為過濾條件，將蛋白名稱校正為基因符號，得到黃芪的靶基因。

1.2 篩選VMC相關基因

在GeneCards數(shù)據(jù)庫與OMIM數(shù)據(jù)庫檢索“viral myocarditis”，對結果進行篩選并去重，得到VMC相關基因。

1.3 獲得黃芪治療VMC的靶基因

利用R 4.0.0對1.1與1.2獲得的基因取交集，即獲得黃芪治療VMC的靶基因。

1.4 構建“黃芪-活性成分-靶基因-VMC”網(wǎng)絡

創(chuàng)建“黃芪-活性成分”“活性成分-靶基因”“VMC-靶基因”關系文件和屬性文件，利用Cytoscape 3.8.0構建“黃芪-活性成分-靶基因-VMC”網(wǎng)絡。

1.5 構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡并篩選核心靶基因

在STRING數(shù)據(jù)庫上傳1.3獲得的基因，篩選條件為種屬選擇人，最小互作分數(shù)值為0.400，得到靶基因相應蛋白的PPI網(wǎng)絡。下載PPI數(shù)據(jù)（TSV文件），利用R 4.0.0計算篩選出PPI網(wǎng)絡的核心蛋白，相應的基因即是核心靶基因。

1.6 基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

在R 4.0.0安裝并運行Bioconductor軟件包“org.Hs.eg.db”，將黃芪治療VMC的靶基因符號轉換成Entrez Gene ID。然后在R 4.0.0安裝Bioconductor軟件包“clusterProfiler”[1]，根據(jù)已轉換的Entrez Gene ID，以P<0.05，Q<0.05進行GO與KEGG通路富集分析，并分別按校正后P從小到大對其排列順序，選擇前20個，繪制條形圖。

2 結果

2.1 獲取并篩選黃芪活性成分，獲得對應的靶基因? 獲取87個黃芪的化學成分，得到20個黃芪活性成分，其對應的靶蛋白校正后獲得靶基因191個。見表1。

2.2 篩選VMC相關基因

在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到847個VMC相關基因，以Score≥10篩選，獲得139個相關基因;從OMIM數(shù)據(jù)庫得到62個VMC相關基因;篩重后獲得VMC相關基因192個。

2.3 獲得黃芪治療VMC的靶基因

191個黃芪的靶基因與192個VMC相關基因取交集得到34個交集基因，即為黃芪治療VMC的靶基因。見圖1。

2.4 構建“黃芪-活性成分-靶基因-VMC”網(wǎng)絡

經(jīng)統(tǒng)計，34個黃芪治療VMC的靶基因對應著黃芪的6個活性成分，分別是槲皮素、異鼠李素、山柰酚、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮、7-O-methylisomucronulatol，構建“黃芪-活性成分-靶基因-VMC”網(wǎng)絡。藍色長方形代表VMC，紅色八邊形代表黃芪，黃色菱形代表黃芪的活性成分，綠色圓形代表黃芪治療VMC的靶基因，灰色連線代表各節(jié)點間相互關系。見圖2。

2.5 構建PPI網(wǎng)絡并篩選核心靶基因

獲得黃芪治療VMC的靶基因相應PPI網(wǎng)絡見圖3，無游離蛋白，456條邊代表了蛋白之間的相互作用。得到PPI網(wǎng)絡核心蛋白的條圖見圖4。左列為蛋白符號，數(shù)字為相應蛋白鄰接節(jié)點數(shù)目。蛋白相應基因即是核心靶基因，按蛋白鄰接節(jié)點數(shù)目由多到少依次為VEGFA、AKT1、IL10、IL6、MMP9、TNF等。

2.6 GO富集分析

黃芪治療VMC的靶基因富集到的生物學過程與功能有1 938個。見圖5。左字母為GO名稱，條形圖代表富集在GO上的基因，圖下數(shù)字為富集在GO上的基因數(shù)，P代表富集的顯著性，顏色越紅代表富集程度越高。黃芪治療VMC的靶基因的GO富集主要涉及：細胞因子受體結合、細胞黏附的調節(jié)、對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、細胞因子活性、白細胞-細胞黏附的調節(jié)、白細胞-細胞黏附、T細胞活化、細胞黏附的正向調節(jié)、細胞間黏附的正向調節(jié)、白細胞-細胞黏附的陽性調節(jié)、外源性凋亡信號通路、T細胞活化的調節(jié)、細胞對生物刺激的反應、細胞因子產(chǎn)生的正調控、脂多糖的細胞反應、受體配體活性、細菌源性分子的細胞反應、活性氧代謝過程的正調控、對抗生素的反應等。

2.7 KEGG通路富集分析

黃芪治療VMC的靶基因富集到的通路有134條。見圖6。左字母為KEGG名稱，條形圖代表富集在KEGG上的基因，圖下數(shù)字表示富集在KEGG上的基因數(shù)，P表示富集的顯著性，顏色越紅則富集程度越高。黃芪治療VMC的靶基因，主要涉及下列KEGG通路：AGE-RAGE信號通路（糖尿病并發(fā)癥中）、IL-17信號通路、乙型肝炎通路、甲型流感通路、查加斯病（美國錐蟲?。┩?、人巨細胞病毒感染通路、腫瘤壞死因子信號途徑、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路、瘧疾通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、肺結核通路、丙型肝炎通路、炎癥性腸病通路、麻疹通路、Toll樣受體信號通路、胰腺癌通路、利什曼病通路、弓形蟲病通路、EB病毒感染通路、膀胱癌通路等。

3 討論

VMC當屬于中醫(yī)學“心悸”“胸痹”等范疇，病機為正虛邪侵，而以正虛為本，臨床常見氣短乏力、心悸怔忡、口干咽燥等癥狀。黃芪氣溫，味甘平，為補藥之長，能補虛扶正，正存邪去。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪治療VMC的主要活性成分槲皮素、異鼠李素、山柰酚、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮、7-O-methylisomucronulatol都屬于黃芪的黃酮類成分[2]。有研究表明，槲皮素可減輕柯薩奇病毒B3（CVB3）誘導的新生小鼠VMC氧化應激損傷和炎癥反應，可增強超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）和乳酸脫氫酶（LDH）水平，抑制IL-1β、IL-6和iNOS分泌，減弱TGF-β1、p-核因子κB P65和TNF-α表達[3]。異鼠李素也有明顯的抗氧化活性[4]。凋亡是VMC細胞死亡的主要機制之一[5]，山柰酚可明顯改善LPS引起的大鼠心肌H9c2細胞活性降低，減少凋亡的發(fā)生[6]。目前尚未見刺芒柄花素、毛蕊異黃酮及7-O-methylisomucronulatol作用于VMC的相關報道，但在構建的“黃芪-活性成分-靶基因-VMC”網(wǎng)絡中，這三者都與MAPK14相關聯(lián)。MAPK14的表達異?？梢詫е旅庖吖δ苁д{及生理功能紊亂，主要涉及應激條件下引起的凋亡與炎癥反應[7]。因此推測刺芒柄花素、毛蕊異黃酮及7-O-methylisomucronulatol可能通過抗炎、調節(jié)免疫及減少凋亡等作用治療VMC，這值得進一步研究。

在PPI網(wǎng)絡核心蛋白對應的核心靶基因中，VEGFA、AKT1、IL10、IL6、MMP9、TNF位于核心位置。VEGFA（也稱為VEGF）編碼VEGF，研究顯示，感染CVB3所致VMC的BALB/c小鼠心肌組織VEGF mRNA表達較正常組高，且在感染病毒后表達漸增高，14 d達最高峰，且VEGF mRNA表達與心肌病理損害程度密切相關[8]。AKT1編碼的AKT1，是AKT激酶家族3種亞型之一，PI3K/AKT通路被證實是控制心肌細胞成活和功能的、最重要的促增殖及抗凋亡信號通路之一[9]。IL10、IL6分別編碼IL10、IL6，研究發(fā)現(xiàn)，感染CVB3的BALB/c小鼠，在2～4周內心肌組織產(chǎn)生的IL6及IL10 mRNA在各時期的表達量均顯著高于對照組，在0～6周各時期中的血漿IL-6及IL-10蛋白水平均顯著高于對照組相應時期[10]。MMP9編碼MMP9，研究顯示，小鼠心肌的MMP9在VMC早期就表達增高，MMP9可能通過介導Ⅰ型膠原的降解代謝來參與VMC的病理過程，是導致VMC膠原重構及心肌纖維化的重要因素之一[11]。TNF編碼TNF，TNF曾分為α和β2種，TNF-α即經(jīng)典的TNF，研究顯示，VMC小鼠TNF-α水平升高，并與心肌病理損害程度密切相關，降低血清TNF-α水平，可能是黃芪治療VMC的作用機制之一[12]。

黃芪治療VMC靶基因的GO富集集中于：細胞黏附的調節(jié)、白細胞-細胞黏附的調節(jié)、白細胞-細胞黏附、細胞黏附的正向調節(jié)等細胞黏附相關功能;細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性等分子功能;對脂多糖的反應、細胞對生物刺激的反應、脂多糖的細胞反應等細胞反應相關功能;T細胞活化、T細胞活化的調節(jié)等T細胞活化相關功能。提示黃芪治療VMC的靶基因可能通過影響這些生物學過程來促進VMC的好轉。

黃芪治療VMC靶基因的KEGG通路富集集中在乙型肝炎、甲型流感、人巨細胞病毒感染、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、麻疹、丙型肝炎、EB病毒感染、查加斯?。绹F蟲?。懠?、利什曼病、弓形蟲病、肺結核、炎癥性腸病、Toll樣受體等相關信號通路上，這些富集信息與微生物感染、炎癥反應及免疫因素相關，由此推測，黃芪可能是通過抑制病毒、減輕炎癥反應以及調節(jié)免疫功能來治療VMC。

馬恒等[13]研究證實了AGE-RAGE可導致的糖尿病心肌功能障礙，這提示VMC的心功能障礙可能與AGE-RAGE信號通路激活有關。研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在小鼠VMC的發(fā)病機制中起重要作用，用抗IL-17中和IL-17可改善臨床癥狀，延緩病情，降低血清IL-17水平;VMC患者IL-17水平明顯高于正常水平，經(jīng)積極治療見效后，IL-17水平明顯降低;這些均表明IL-17信號通路在VMC的進展中起重要作用[14-15]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與健康兒童比較，VMC患兒外周血TNF-α的蛋白水平及mRNA表達水平明顯升高[16-17]，提示TNF-α參與VMC的發(fā)病過程，而黃芪顆粒聯(lián)合常規(guī)治療在明顯提高療效的同時，可明顯降低血清中TNF-α水平（比常規(guī)治療顯著）。研究表明，VMC患者血管內皮依賴性舒張功能受損明顯，而層流剪切應力誘導的NO生成在內皮功能和血管內穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用，當歸補血湯對低流體剪切應力作用下的內皮細胞功能損傷具有一定的保護作用，且在黃芪占比增大時，保護效應更顯著[18-20]。

本研究也存在一些不足，首先，由于有篩選條件限制，不能納入所有的化學成分，且可能存在尚未發(fā)現(xiàn)或鑒定的化學成分。例如，黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ）是黃芪的皂苷類成分之一，目前已有不少關于口服黃芪甲苷治療CMV的實驗研究報道，已證實其有抗VMC的作用，但由于黃芪甲苷OB值只有22.50%，類藥性值只有0.15，沒達到篩選標準，且在TCMSP中又無相應預測靶蛋白，因此未囊括在本研究中。其次，基于網(wǎng)絡藥理學可得到黃芪活性成分與靶基因的相關性，但不能明確具體調控關系。另外，由于未考慮中藥在體內的復雜代謝過程，使得研究預測的結果具有一定的局限性。因此，要證實網(wǎng)絡預測的結果，還需要進行進一步的實驗研究。

綜上所述，黃芪是通過多成分、多靶點、多通路來治療VMC的，本研究初步揭示了黃芪治療VMC的核心靶基因和涉及的生物學過程及信號通路，為后續(xù)深入研究提供一定參考。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)刺芒柄花素、毛蕊異黃酮、7-O-methylisomucronulatol有潛在治療VMC的作用，值得進一步實驗研究。

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（2020-11-10收稿 責任編輯：楊覺雄）