小鼠角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)研究進展

金銘，劉莉萍，李遇梅

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

角質(zhì)形成細胞又稱角蛋白形成細胞，來源于外胚層，是表皮的主要細胞類型，約占表皮的95%。根據(jù)角質(zhì)形成細胞不同分化階段的細胞特點，將表皮分為5層：基底層、棘層、顆粒層、透明層和角質(zhì)層，其中基底層是未分化的細胞，具有分裂增殖能力[1]。角質(zhì)細胞構(gòu)成完整的皮膚屏障以抵御外界各種物理、化學(xué)物質(zhì)和病原微生物的損傷，當(dāng)這層屏障由于外傷、感染、免疫反應(yīng)等原因功能受損時，將會導(dǎo)致一系列皮膚疾病的發(fā)生，比較典型的有銀屑病、天皰瘡、大皰性表皮松懈癥。因此目前有很多與之相關(guān)的研究，例如上皮生物學(xué)、角質(zhì)細胞分化以及角質(zhì)細胞刺激先天免疫反應(yīng)[2]等等。近年來，為了更好地修復(fù)皮膚慢性損傷、燒燙傷，人工皮膚的研究進行得如火如荼，而角質(zhì)細胞在人工皮膚的構(gòu)建方面是必不可少的[3-4]。

小鼠是當(dāng)前用于研究人類疾病最重要的模式生物，通過基因編輯技術(shù)，小鼠角質(zhì)細胞已被廣泛用于研究表皮屏障、瘢痕形成、銀屑病等生理病理機制以及關(guān)鍵分子的調(diào)控[5-8]。其中，角質(zhì)形成細胞的維持培養(yǎng)為此類研究提供了不可或缺的體外模型。小鼠角質(zhì)細胞的培養(yǎng)起始于20世紀70年代，半個世紀以來，培養(yǎng)技術(shù)和方式在不斷改進和細化。然而，小鼠角質(zhì)細胞在體外傳代過程中很容易發(fā)生分化和衰老，而且存在貼壁困難、成纖維細胞污染等問題。本文回顧了近年來國內(nèi)外有關(guān)小鼠角質(zhì)細胞分離培養(yǎng)的文獻，總結(jié)影響其體外增殖、分化的各個因素，以期建立更加優(yōu)化的培養(yǎng)體系。

1 小鼠相關(guān)參數(shù)確定

1.1 品系的選擇

多種品系的小鼠均可用于角質(zhì)形成細胞的來源，但不同的小鼠品系之間，角質(zhì)細胞的培養(yǎng)壽命和質(zhì)量各不相同。與FVB/N、CD-1、C57BL/6或SENCAR品系的小鼠相比，BALB/c小鼠角質(zhì)形成細胞的初始貼壁率最低，衰老傾向最高[9]。

1.2 小鼠年齡和取材部位的選擇

不同鼠齡的小鼠取材部位不同，對于出生0～3 d的新生小鼠，最佳的取材部位是背部皮膚，因為此時是毛囊形成早期，毛囊數(shù)量很少[10]，對后續(xù)表真皮的分離影響較小。而對于成年小鼠，最佳的取材部位則是尾部而非背部，因為：① 成年小鼠的毛發(fā)周期處于休眠期(通常是出生后6～12周的背部皮膚)，此時的皮膚很薄，僅包含1～2層細胞，這將會導(dǎo)致角質(zhì)細胞產(chǎn)量低下；② 成年小鼠背部皮膚的毛囊密度較高，這增加了表皮與真皮分離的困難程度；③ 尾部皮膚部位上皮細胞較厚，有3～5層角質(zhì)細胞，并且還具有較低的毛囊密度，不干擾表真皮分離[2]。

2 消化酶的選擇

小鼠角質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)方式有3種：組織塊培養(yǎng)法、氣-液交界面培養(yǎng)法和酶消化法。目前應(yīng)用最廣的是二步酶消化法[11-12]，即先使用表真皮分離酶分離表真皮，再對表皮進行消化得到角質(zhì)細胞。此外，也有研究使用一步法，即在表真皮分離的同時對表皮進行消化。

2.1 表真皮消化酶

表皮和真皮通過半橋粒和基底膜帶連接?；啄в砂?、透明層、致密層和致密下層等4層結(jié)構(gòu)組成，主要成分為板層素、Ⅳ型膠原等。目前有多種消化酶可用于表真皮分離，它們作用于不同的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的結(jié)果也不盡相同。

2.1.1中性蛋白酶 中性蛋白酶是目前應(yīng)用最廣的表真皮分離酶[2，13]。它是由枯草芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵提取獲得的，由于特異性作用于基底膜 Ⅳ型膠原和纖維黏連蛋白，因此只破壞半橋粒，而不破壞橋粒，不會影響表皮細胞之間的連接[14]。

2.1.2 胰蛋白酶 胰蛋白酶作用強度大，且操作最為簡單方便，也常常用于分離表真皮[9，15]。它在破壞半橋粒的同時也破壞橋粒的連接作用，因此會作用于基底細胞和棘細胞，可實現(xiàn)一步法分離角質(zhì)形成細胞。然而，此種方法易造成基底細胞丟失和成纖維細胞污染的問題[16]。

2.1.3 嗜熱菌蛋白酶 嗜熱菌蛋白酶是從嗜熱微生物芽孢桿菌培養(yǎng)濾液中分離出的一種熱穩(wěn)定的胞外金屬內(nèi)肽酶[17]，它是特異性地作用于真皮-表皮交界處的一種特定蛋白，利用這種酶可以獲得完整的表皮[18]。Rakhorst等[19]比較了中性蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶對表真皮分離的作用，發(fā)現(xiàn)在中性蛋白酶的作用下，表真皮更易分離、角質(zhì)細胞的產(chǎn)量更高。而且，由于嗜熱菌蛋白酶價格較高，因此應(yīng)用不多。

綜上，考慮到酶的作用原理、效果以及產(chǎn)品價格等綜合因素后，目前更推薦中性蛋白酶用于表真皮的消化分離。

2.2 表皮消化酶

角質(zhì)形成細胞間主要通過橋粒連接，破壞此結(jié)構(gòu)可使角質(zhì)細胞之間相互分離，從而收集到角質(zhì)細胞。

2.2.1 胰蛋白酶-EDTA 由于乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA)能夠螯合Ca2+和Mg2+，從而破壞細胞連接促進細胞的解離，因此在胰蛋白酶中加入EDTA后，解離效果更加明顯，不僅有利于表皮角質(zhì)細胞的分離，也可減少胰蛋白酶對細胞的損傷。

2.2.2 TrypLE解離酶 TrypLE解離酶不含動物和人源性成分，且對細胞的作用十分溫和。終止消化時，不需要使用胰蛋白酶抑制劑，因此可避免血清對角質(zhì)形成細胞造成的負面影響。此外，TrypLE可在室溫下保存，性狀穩(wěn)定。因此是替代胰蛋白酶的理想試劑。

目前的研究大多先使用中性蛋白酶分離表真皮，再通過胰蛋白酶-EDTA或者TrypLE解離酶消化表皮[20]進一步得到角質(zhì)細胞。這種消化組合不僅可以在高效分離出角質(zhì)細胞的同時避免成纖維細胞的污染，還能提高貼壁細胞的增殖率[12]。

3 培養(yǎng)基的選擇

小鼠角質(zhì)細胞的培養(yǎng)已有50年的歷史，其培養(yǎng)基也在逐漸改良創(chuàng)新。目前，小鼠角質(zhì)細胞的培養(yǎng)基大致可以分為含血清與不含血清兩大類。

3.1 含血清培養(yǎng)基

這類培養(yǎng)基一般在EMEM/S-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入胎牛血清、氯化鈣、上皮生長因子、氫化可的松等成分。其中，胎牛血清雖然富含最全面的細胞培養(yǎng)所需的營養(yǎng)物質(zhì)，例如白蛋白、胎球蛋白、Ig類抗體、膽固醇等，可以幫助細胞抵御外界的各種環(huán)境變化帶來的沖擊，但血清中的鈣離子抑制角質(zhì)形成細胞的生長并誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞的終末分化。因此，需先用螯合樹脂處理血清，以去除包括鈣離子在內(nèi)的二價和三價陽離子，才能顯著降低對細胞生長的抑制作用[21]。

3.2 不含血清培養(yǎng)基

這類培養(yǎng)基通過加入一些成分明確的血清替代成分，例如牛血清白蛋白等，可避免血清給角質(zhì)形成細胞帶來的諸多不利因素。目前最常用的商業(yè)化無血清培養(yǎng)基有以下幾種。

3.2.1 EpiLife無血清培養(yǎng)基 有研究表明，與添加了螯合處理血清的培養(yǎng)基相比， EpiLife培養(yǎng)基在促進成年小鼠角質(zhì)細胞增殖、保持基底細胞形態(tài)方面表現(xiàn)更為優(yōu)秀[2]。也有研究比較了幾種不同的商業(yè)化無血清培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)EpiLife在促進角質(zhì)細胞增殖方面的作用較為突出[22]。

3.2.2 CnT(CELLnTEC)系列培養(yǎng)基 CnT系列培養(yǎng)基是CELLnTEC公司最新研發(fā)的針對角質(zhì)細胞培養(yǎng)的一類培養(yǎng)基，根據(jù)作用原理和效果不同主要分為以下幾類，① CnT-57：含有少量(6 μg/mL)的牛垂體提取物(bovine pituitary extract, BPE)，它對于體外維持祖細胞的未分化增殖狀態(tài)具有重要作用，能提供最大的角質(zhì)細胞分離效率，維持良好的原代細胞生長狀態(tài)，但也能支持原代培養(yǎng)中黑素細胞或成纖維細胞的生長[23]。② CnT-07：也是促祖細胞增殖培養(yǎng)基。與CnT-57相比，分離角質(zhì)細胞后的集落形成效率稍低，但不支持除角質(zhì)細胞以外的其他細胞的生長[23]，是目前使用最多的促角質(zhì)細胞生長的CnT培養(yǎng)基。③ CnT-PR：是一種成分明確、不含動物成分的培養(yǎng)基。它是CnT-07培養(yǎng)基的改進版本，優(yōu)化了培養(yǎng)基的成分，添加了額外的微量元素、抗氧化劑和維生素，還補充了一系列的前體細胞靶向生長因子以及輔助因子，以延長祖細胞壽命、改善生長因子與膜結(jié)合受體的結(jié)合。④ CnT-02：用于角質(zhì)形成細胞的分化培養(yǎng)。當(dāng)細胞被誘導(dǎo)分化時，用以代替促進增殖的CnT-57或CnT-07培養(yǎng)基[23]。CnT-PR-D作為CnT-02分化培養(yǎng)基的改良版本，添加了額外的微量元素、抗氧化劑和維生素，使得對角質(zhì)細胞的分化作用更為顯著。

3.2.3 成分確定的角質(zhì)形成細胞-無血清培養(yǎng)基(defined keratinocyte-SFM) 不添加BPE，取而代之的是生長促進劑，這些生長促進劑可維持細胞形態(tài)、生物標(biāo)志物和生長特性，并可抑制成纖維細胞的增殖。此培養(yǎng)基鈣濃度很低(<0.1 mmol/L)，因而可用于高密度未分化角質(zhì)形成細胞的分離和培養(yǎng)。

3.2.4 KGM-Gold角質(zhì)形成細胞生長培養(yǎng)基 旨在支持克隆生長和高密度角質(zhì)細胞增殖。在此培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的角質(zhì)細胞能通過嚴格的質(zhì)量控制，確保過大的和空泡化的細胞數(shù)量最少。

4 影響角質(zhì)細胞培養(yǎng)的重要因素

4.1 鈣離子

鈣濃度的變化會影響角質(zhì)形成細胞的分化。在不同鈣濃度培養(yǎng)條件下，細胞的增殖能力出現(xiàn)明顯的差異。研究表明，低鈣濃度下(<0.07 mmol/L)，角質(zhì)形成細胞可良好增殖，但不能分化為層狀細胞；當(dāng)鈣濃度超過0.1 mmol/L時，角質(zhì)細胞的增殖受到抑制，而分化過程被啟動[24]。因此，目前的體外培養(yǎng)體系中多采用低鈣來延長原代角質(zhì)形成細胞的壽命[25]，研究者也可根據(jù)實驗需要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的鈣離子濃度。

4.2 生長因子

4.2.1 表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF) EGF是一種由53個氨基酸殘基組成的耐熱單鏈低分子多肽，參與上皮細胞成熟，它與EGF受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)結(jié)合，后者廣泛分布于哺乳動物的上皮細胞膜上，平均每個正常上皮細胞約有(2～5)×104個EGFR分子[26]，EGF和EGFR的結(jié)合會影響角質(zhì)細胞的增殖、分化和遷移[27-28]。

4.2.2 角質(zhì)細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF) KGF是成纖維細胞生長因子家族的成員，由間質(zhì)來源的細胞產(chǎn)生，并通過與位于上皮的KGF受體連接而具有旁分泌功能[29]。KGF通過上調(diào)與DNA合成相關(guān)的基因如c-myc、CHL-1等，促進細胞有絲分裂。研究表明，KGF促進角質(zhì)細胞增殖的作用強度是EGF的2～10倍[30]。

4.3 鎂離子

研究表明，培養(yǎng)基中添加高濃度鎂離子(最適濃度5～6 mmol/L)可使新生鼠角質(zhì)形成細胞DNA含量增加3～4倍。其他二價陽離子(鍶、銅、鋅、鎳、鈹和鋇)在培養(yǎng)基中不能促進角質(zhì)形成細胞的生長[31]。此外，鎂離子可能通過與細胞表面的蛋白螯合，形成表面蛋白膜，從而促進角質(zhì)細胞貼壁生長[32]?？傊?，鎂離子可以促進角質(zhì)細胞的增殖，提高貼壁率和細胞的生長速率。

4.4 1,25-二羥維生素D3

1,25-二羥維生素D3是膽固醇衍生物維生素D3的一種活性形式，對于骨代謝、鈣代謝的調(diào)節(jié)，細胞生長分化，免疫系統(tǒng)功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能都有重要調(diào)節(jié)作用[33-34]。研究表明，1,25-二羥維生素D3通過上調(diào)周期蛋白D1(CCND1)基因和其編碼的cyclin D1蛋白表達刺激角質(zhì)細胞的增殖[35]。

除了上述幾種因素外，部分激素如氫化可的松、胰島素以及霍亂毒素等都能顯著促進角質(zhì)形成細胞的增殖、生長。其中胰島素通過促有絲分裂作用刺激角質(zhì)形成細胞的增殖[36]；霍亂毒素作為一種環(huán)狀單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的誘導(dǎo)劑，對于角質(zhì)細胞的生長具有較強的促進作用[37]。

5 小鼠角質(zhì)細胞的應(yīng)用展望

經(jīng)過半個世紀的研究和探索，小鼠角質(zhì)細胞的培養(yǎng)尤其是原代培養(yǎng)取得了很大的進展，然而，如何維持其干性、促進增殖依然存在著較大困難和挑戰(zhàn)。建立成熟完善的小鼠角質(zhì)形成細胞的分離和培養(yǎng)體系，將有助于研究細胞間的相互作用，構(gòu)建細胞分化模型以及三維皮膚替代物，進而服務(wù)于瘢痕形成、銀屑病、皮膚腫瘤等病理過程的機制探索，并助力皮膚相關(guān)的再生研究。結(jié)合最新的細胞重編程技術(shù)，還能將其應(yīng)用于各類體內(nèi)外的轉(zhuǎn)化研究，例如將角質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為干細胞、黑素細胞等，這將為細胞治療和再生醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)展帶來裨益。相信在不久的將來，一套成熟的小鼠角質(zhì)細胞培養(yǎng)體系能夠被建立起來。