ECLIA與ELISA用于乙肝病毒血清學(xué)檢驗(yàn)效能對(duì)比分析

王麗萍

乙型病毒性肝炎(簡(jiǎn)稱乙肝)，是指患者受乙肝病毒(HBV)入侵，致使肝臟發(fā)生病變及其他器官受損的一種臨床常見慢性傳染性疾病，具有發(fā)病緩慢、高傳染率及傳播途徑廣泛等特征[1]。乙肝主要是通過(guò)精液或血液等途徑傳播，患者若無(wú)法得到及時(shí)有效的治療，則較易并發(fā)肝癌、肝衰竭及肝硬化等，嚴(yán)重者會(huì)直接威脅到生命安全[2]。大多數(shù)乙肝患者發(fā)病癥狀不明顯，易出現(xiàn)誤診與漏診現(xiàn)象。因此，給予患者快速準(zhǔn)確的診斷具有十分重要的意義。目前，臨床對(duì)乙肝患者進(jìn)行診斷及對(duì)預(yù)后進(jìn)行評(píng)估的主要依據(jù)是乙肝病毒DNA與乙肝病毒血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果。但由于乙肝病毒DNA檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件的要求較高，因此臨床上大多是給予患者血清學(xué)乙肝五項(xiàng)檢測(cè)方式[3]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)憑借其簡(jiǎn)便的操作及低廉的成本已成為目前臨床應(yīng)用較為廣泛的一種檢測(cè)方式，也是乙肝血清學(xué)標(biāo)志物主要檢測(cè)方式[4]。隨著近年來(lái)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，化學(xué)發(fā)光法(ECLIA)以其快速的檢測(cè)速度、良好的精密度、高敏感性、較寬的線性范圍及廣泛的應(yīng)用范圍等優(yōu)勢(shì)，被逐漸引入臨床診斷治療中。由于ECLIA與ELISA各異的檢測(cè)特性與原理，會(huì)導(dǎo)致其在乙肝血清學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果不同[5]。目前，臨床醫(yī)學(xué)界對(duì)以上兩種檢測(cè)方式的診斷價(jià)值仍無(wú)統(tǒng)一的定論。基于此，本資料主要探討對(duì)乙肝患者臨床治療中分別選用ECLIA與ELISA進(jìn)行檢測(cè)的效果及價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年12月—2020年12月于本院門診部就診的乙肝患者66例作為研究對(duì)象。A組33例，其中：男15例，女18例；年齡：20～57(33.7±3.7)歲。B組33例，其中：男14例，女19例；年齡：19～58(33.2±2.6)歲。2組患者性別、年齡等基線統(tǒng)計(jì)學(xué)資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《病毒性肝炎防治方案》[6]中乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)均屬于門診病例患者；(3)已簽署相關(guān)知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有惡性腫瘤者；(2)存在重要臟器(心、腎)等嚴(yán)重功能不全者；(3)存在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、認(rèn)知障礙、精神性疾病，治療依從性差者。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 采取患者晨時(shí)空腹條件下的靜脈血10 mL，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后取上層血清，置于-20 ℃的冰箱內(nèi)待檢。按先后順序進(jìn)行ELISA與ECLIA檢驗(yàn)。

1.3.2 ELISA檢測(cè) 采用伯樂(lè)iMark型酶標(biāo)儀、伯樂(lè)1575型洗板機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，試劑由上海榮盛生物藥業(yè)有限公司提供，對(duì)血清樣本實(shí)施雙抗體夾心法檢測(cè)HBsAg。全程操作嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書進(jìn)行，將微孔反應(yīng)條與試劑盒放在室溫下平衡30 min，然后將待檢血清及陰陽(yáng)性對(duì)照加入微孔反應(yīng)條中，進(jìn)行封片后將其置于37 ℃的水浴中孵育60 min后取出，再加入酶結(jié)合物，實(shí)施封板后將其置于37 ℃的水浴中孵育30 min后取出，將微孔反應(yīng)條中的液體棄去，并進(jìn)行反復(fù)5次洗滌后，加入顯色劑再孵育30 min后加入終止液，用酶標(biāo)儀讀數(shù)，若血清OD值≥臨界值，即為陽(yáng)性。另HBsAb采用雙抗原夾心法，若血清OD值≥臨界值，即為陽(yáng)性。HBeAg采用雙抗體夾心法，若血清OD值≥臨界值，即為陽(yáng)性。HBeAb采用中和競(jìng)爭(zhēng)法，若血清OD值≥臨界值，即為陰性。HBcAb采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法，若血清OD值≥臨界值，即為陰性。所有操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.3 ECLIA檢驗(yàn) 采用四川邁克生物股份有限公司的i3000型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)，試劑為其配套試劑。采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法，利用雙抗體夾心法原理檢測(cè)HBsAg，通過(guò)免疫分析兩步法實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的檢測(cè)。第一步，將樣本和包被抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體的免疫磁微粒混合，樣本中的HBsAg與抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體結(jié)合，形成抗原—抗體復(fù)合物；第二步，洗滌后加入吖啶酯標(biāo)記的抗乙型肝炎病毒表面抗原多克隆抗體，形成抗體—抗原—抗體免疫復(fù)合物；再次洗滌，加入底物液發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，測(cè)量相對(duì)發(fā)光值，相對(duì)發(fā)光值與樣本中HBsAg的含量成正比關(guān)系。另HBsAb采用雙抗原夾心法，HBeAg采用雙抗體夾心法，HBeAb采用中和競(jìng)爭(zhēng)法，HBcAb采用間接法。

1.3.4 重復(fù)性檢驗(yàn) 將22份低、中、高濃度的乙肝表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性血清進(jìn)行冷凍保存處理，每天測(cè)量1次，對(duì)其中的11份進(jìn)行批間重復(fù)性計(jì)算，另11份則進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性計(jì)算。

1.4 觀察指標(biāo) (1)觀察計(jì)算2組檢測(cè)準(zhǔn)確度。(2)觀察2組乙肝5項(xiàng)陽(yáng)性率的檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：若檢測(cè)值大于等于參考上限值則判定為陽(yáng)性。各指標(biāo)參考上限值標(biāo)準(zhǔn)如下：乙肝表面抗原(HBsAg)為0.05 IU/mL；乙肝表面抗體(HBsAb)為10.0 mIU/mL；乙肝e抗原(HBeAg)為0.1 IU/mL；乙肝e抗體(HBeAb)為0.2 IU/mL；乙肝核心抗體(HBcAb)為0.6 IU/mL[7]。(3)觀察對(duì)比2組在低、中、高三種濃度的HBsAg批內(nèi)與批間的檢測(cè)重復(fù)率。

2 結(jié)果

2.1 2種檢測(cè)方法檢測(cè)準(zhǔn)確度比較 A組檢測(cè)乙肝5項(xiàng)的準(zhǔn)確度為93.93%，高于B組的75.75%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2種檢測(cè)方法的檢測(cè)準(zhǔn)確度比較 (例)

2.2 2種檢測(cè)方法檢測(cè)乙肝5項(xiàng)的陽(yáng)性率比較 A組檢測(cè)HBsAg、HBeAg及HBeAb的陽(yáng)性率高于B組(P<0.05)；2組檢測(cè)HBsAb與HBcAb的陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 2種檢測(cè)方法檢測(cè)乙肝5項(xiàng)的陽(yáng)性率比較

2.3 2組檢測(cè)重復(fù)率比較 2組對(duì)高濃度HBsAg含量批內(nèi)與批間的重復(fù)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組對(duì)低、中濃度HBsAg含量批內(nèi)與批間檢測(cè)重復(fù)率高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組檢測(cè)重復(fù)率比較

3 討論

乙肝是一種強(qiáng)傳染性疾病，主要是由于患者受乙肝病毒的感染所致。乙肝病毒長(zhǎng)時(shí)間潛伏于人體，當(dāng)其被激活時(shí)，就會(huì)引發(fā)乙型肝炎[8-9]。乙肝患者發(fā)病期并無(wú)明顯的臨床癥狀，因此檢測(cè)過(guò)程中患者誤診與漏診率均較高。乙肝患者隨著病情的加重會(huì)并發(fā)肝硬化或肝癌，不僅對(duì)其身心健康造成嚴(yán)重影響，還會(huì)威脅到其生命安全[10]。因此，給予乙肝患者早期準(zhǔn)確的診斷對(duì)其臨床治療與預(yù)后均具有非常重要的意義。乙肝的防治工作主要是遵循以預(yù)防為主，預(yù)防與治療相互結(jié)合的原則。目前，檢測(cè)乙肝病毒血清的主要方法為ECLIA與ELISA檢測(cè)法[11]。其中ELISA檢測(cè)法具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，可用于檢測(cè)大批量標(biāo)本，但此種方法僅可實(shí)施定性分析，且操作過(guò)程易受其他因素影響，進(jìn)而對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成影響[12]。

ELISA檢驗(yàn)法又名固相酶聯(lián)免疫法，是使用酶對(duì)抗原(抗體)進(jìn)行標(biāo)記的反洗技術(shù)[13]。酶具有高效生物催化作用，可促使抗原(抗體)于幾分鐘后被識(shí)別出來(lái)。該種檢測(cè)方式技術(shù)可靠，且較易自動(dòng)化，是目前傳統(tǒng)的HBsAg篩查方式[14]。但有研究[15]表明，ELISA法使用的是間接法測(cè)定，其不能實(shí)現(xiàn)定量分析，加之操作過(guò)程較易受到孵育時(shí)間、洗板等眾多因素的影響，檢測(cè)結(jié)果通常會(huì)出現(xiàn)一定誤差；且難以對(duì)乙肝病毒感染進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察；此外，該種檢驗(yàn)方式因微孔板間的間隔距離較近，加之操作時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，易受各種因素影響而受污染，從而影響檢驗(yàn)結(jié)果；同時(shí)，其對(duì)高濃度血清樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)易產(chǎn)生假陰性，檢測(cè)準(zhǔn)確率欠佳。本資料結(jié)果中，ECLIA檢測(cè)方式的檢測(cè)準(zhǔn)確率及對(duì)HBsAg、HBeAg及HBeAb的陽(yáng)性檢出率均高于ELISA檢驗(yàn)法，說(shuō)明ECLIA檢測(cè)方式在乙肝血清的檢測(cè)上準(zhǔn)確率更優(yōu)，此與上述研究結(jié)果相近。分析原因可能是ECLIA是目前最科學(xué)且先進(jìn)的一種自動(dòng)化標(biāo)記免疫測(cè)定系統(tǒng)，其結(jié)合了電子發(fā)光技術(shù)、納米微粒子技術(shù)、生物素一親和素系統(tǒng)、抗原一抗體免疫反應(yīng)及電磁場(chǎng)分離等，是高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)技術(shù)相互結(jié)合的產(chǎn)物。ECLIA檢測(cè)原理是運(yùn)用電化學(xué)發(fā)光劑聯(lián)合過(guò)氧化物酶對(duì)抗體(抗原)進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)抗原-抗體反應(yīng)及磁珠分離，在電極表面進(jìn)行特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)此反應(yīng)連接檢測(cè)對(duì)象和酶，再使用免疫反應(yīng)結(jié)合檢測(cè)固相載體上的抗原與檢測(cè)對(duì)象，最后加入底物以顯色，憑借顯現(xiàn)顏色的深淺對(duì)抗體情況進(jìn)行判斷，具有較高的靈敏性和特異性。ECLIA是通過(guò)光電信號(hào)進(jìn)行判斷，因此突變抗體對(duì)其影響度較少，且其還可快速做出反應(yīng)，靈敏度高；其標(biāo)記物的來(lái)源較為豐富，可對(duì)各種逃逸的變異株進(jìn)行有效識(shí)別，能免除人為因素對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的干擾，因此檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率更高。ECLIA的載體是順應(yīng)性微粒，經(jīng)電磁鐵控制，具有標(biāo)準(zhǔn)化與自動(dòng)化的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，能有效避免因人工操作所導(dǎo)致的檢驗(yàn)誤差，進(jìn)而提升檢驗(yàn)準(zhǔn)確度；此外，檢測(cè)系統(tǒng)能直接發(fā)光，無(wú)需借助外部光源，有利于提升系統(tǒng)的穩(wěn)定性，進(jìn)一步確保了檢測(cè)的精準(zhǔn)度；同時(shí)，來(lái)源于電磁鐵的電磁能迅速消失，可對(duì)抗體和復(fù)合抗體分離進(jìn)行游離抵抗，能有效降低游離抗體所致的假陰性，提升檢測(cè)特異性；ECLIA具有較寬的線性范圍，發(fā)光強(qiáng)度介于4～6個(gè)數(shù)量級(jí)，與測(cè)定物呈線性關(guān)系，能有效防止“鉤狀效應(yīng)”，提升檢測(cè)特異性和靈敏度。本資料結(jié)果中，ECLIA檢測(cè)法在中、低濃度HBsAg含量批內(nèi)與批間的重復(fù)率均顯著高于ELISA檢驗(yàn)法，而2種檢驗(yàn)方式對(duì)高濃度的HBsAg含量批內(nèi)與批間的重復(fù)率均較高，且組間相較無(wú)明顯差異，說(shuō)明ECLIA檢驗(yàn)法能更有效的檢出低濃度的HBsAg，其原因可能是ECLIA檢測(cè)法具有較高的靈敏度，因此對(duì)低濃度標(biāo)志物的檢測(cè)率也更優(yōu)，能更為科學(xué)且有效的控制傳染源，具有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，乙肝病毒血清學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用ECLIA與ELISA兩種檢測(cè)方式均能獲得較好的檢測(cè)價(jià)值，但ECLIA檢驗(yàn)方法對(duì)乙肝陽(yáng)性的檢出更為準(zhǔn)確，并能檢出較低濃度的HBsAg，因此其在乙肝血清學(xué)的診斷中效果更加理想。