液相色譜熒光法測定食糖中的多環(huán)芳烴及其消費風(fēng)險評估

李長成，陳其釗*，陳嘉敏，王桂華，黃敏興，高裕鋒

(1廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東廣州510316；2國家糖業(yè)質(zhì)量檢驗檢測中心，廣東廣州510316)

0 引言

多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一大類由2個或多個稠合芳香環(huán)組成的有機化合物。PAHs主要形成于有機物的不完全燃燒和熱解。工業(yè)食品加工(如加熱、干燥和吸煙過程)和家庭食品制備(如燒烤和焙烤過程)是多環(huán)芳烴產(chǎn)生的原因之一。由于其致突變性和致癌作用，PAHs在食品安全方面非常令人關(guān)注。在2002年，前食品科學(xué)委員會(Scientific Committee on Food)確定了15種多環(huán)芳烴為致癌物質(zhì)，并建議使用苯并[a]芘作為食物中致癌多環(huán)芳烴的發(fā)生和影響的指標。

根據(jù)食品安全委員會的意見，為那些生產(chǎn)過程中暴露于多環(huán)芳烴并被發(fā)現(xiàn)含有較高含量多環(huán)芳烴的食品(如油、培根及培根制品、熏魚及熏魚制品、熏魚以外的魚肉、甲殼類動物、頭足類動物、雙殼類軟體動物及嬰兒食品)設(shè)定了苯并[a]芘的最高限量[1]。在2005～2007年間，18個歐盟成員國測試了33個食品類別/次類別的9714個不同的樣本，結(jié)果顯示31.8%的樣本的PAHs水平低于LOD。其中，在糖和糖制品中檢測了巧克力，數(shù)據(jù)顯示總量(PAH8)為 0～2.76 μg/kg。歐洲食品安全局食物鏈污染物科學(xué)小組在2008年更新了其關(guān)于食品中多環(huán)芳烴(PAHs)的觀點[2]，認為苯并[a]芘不是食物中是否含有多環(huán)芳烴的合適標記物，而由 4種特定物質(zhì)(PAH4)或 8種特定物質(zhì)(PAH8)組成的體系將是食物中多環(huán)芳烴的最合適指標，并據(jù)此意見修訂了相關(guān)限值[3]。

有文獻報道在巴西的糖樣(顆粒糖、巴西原糖、冰糖、紅糖、有機糖)中檢出多環(huán)芳烴的比例為57%，含量最高為 1.35 μg/kg，在生蔗汁和炭化蔗汁[4-7]中更高，達3.05 μg/kg?？梢姯h(huán)境中的PAHs可以在甘蔗體內(nèi)遷移、代謝、累積，從而影響甘蔗的正常生長，且可在食物鏈中被逐級放大，影響人類健康。但是目前我國還沒有專門為食糖設(shè)定PAHs限量，對不同食糖中多環(huán)芳烴含量仍不明確。為此，本研究篩選中國市場上 3種類型的食糖對規(guī)定的15種優(yōu)先控制的多環(huán)芳烴進行了檢測，探討多環(huán)芳烴在不同食糖中的分布特征，并對成人攝食每種食糖引起的健康風(fēng)險進行了評估，旨在為定量評價食糖污染的生態(tài)風(fēng)險、保障食品安全質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2017/18 年和2018/19年2個榨季期間，從廣東、廣西、云南糖廠和超市隨機抽取 104個食糖樣品，每個樣品的質(zhì)量在500～750 g之間：其中44個紅糖、13個黑糖、47個赤砂糖樣品。在分析之前，所有食糖樣品都儲存在塑料罐中，陰涼避光保存。

乙醚、石油醚、氯化鈉(分析純，廣州化學(xué)試劑有限公司)；乙腈、正己烷、二氯甲烷(色譜純，賽默飛公司)；16種多環(huán)芳烴標準溶液(200 μg/mL，上海安譜實驗科技股份有限公司)；QuEChERS凈化管，Cleanert Florisil固相萃取柱(天津博納艾杰爾科技有限公司)；MIP-PAHs固相萃取柱(500 mg/6 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司)。

由于苊烯(Acy)沒有熒光吸收，本文中只討論分析 15 種代表性 PAHs：萘(Nap)，苊(Ace)，芴(Fln)，菲(Phe)，蒽(Ant)，熒蒽(Flt)，苯并[a]芘(BaP)，芘(Pyr)，苯并[a]蒽(BaA)，苯并[b]熒蒽(BbF)，苯并[k]熒蒽(BkF)，二苯并[a,h]蒽(DhA)，苯并[g,h,i]苝(BpE)，茚并[1,2,3-c,d]芘(InP)，?(CHR)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695型高效液相色譜儀，配備 2475熒光檢測器(美國 Waters公司)；色譜柱 ZORBAX Eclipse PAH(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美國安捷倫公司)；CL5R醫(yī)用離心機(湖南湘儀公司)；N-EVAP 112氮吹濃縮儀(美國Organomation公司)；12位固相萃取儀(上海安譜實驗科技股份有限公司)；渦旋儀(德國IKA公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

配置濃度為(200±0.2) μg/mL的16種多環(huán)芳烴的混標溶液，置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，于4℃下避光儲存?zhèn)溆?。取適量部分上述標準儲備液用乙腈配制成濃度分別為 1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL系列標準工作液。

1.3.2 樣品制備

通過總結(jié)文獻[8-13]的研究方法，以及前期的實驗探索，比較了乙腈、正己烷、二氯甲烷作為萃取溶劑的提取效率和 MIP-PAH、QuEChERS以及Cleanert Florisil的凈化效果。不同提取溶劑的提取效果的色譜見圖1，根據(jù)響應(yīng)值最終確定以正己烷∶二氯甲烷(1∶1)作為萃取溶劑。不同凈化方式的凈化效果的色譜見圖2，結(jié)果顯示Cleanert Florisil柱凈化的回收率最好，為 72%～113%。具體操作為：稱取3 g試樣于離心管中，加入3 mL水。在渦旋溶解后，加入5 mL正己烷∶二氯甲烷(1∶1)溶液再渦旋后5 min。然后將樣品以4000 r/min離心5 min，取上層有機層。共萃取3次，合并有機層，氮氣吹至近干。加入5 mL正己烷，渦旋振蕩30 s溶解，待凈化。依次用5 mL二氯甲烷和10 mL正己烷活化Cleanert Florisil柱，將待凈化液全部移入Cleanert Florisil柱，再用5 mL正己烷潤洗1次，用8 mL正己烷-二氯甲烷混合溶液洗脫，收集所有流出物于20 mL玻璃離心管中。氮吹近干，用乙腈定容至1 mL，混勻后，過0.22 μm濾膜，制得試樣待測液[14]。

圖1 不同提取溶劑的提取效果色譜圖

圖2 不同凈化方式的凈化效果色譜圖

1.3.3 色譜條件

使用Waters e2695 HPLC進行色譜分析，2475熒光檢測器和Empower3軟件，ZORBAX Eclipse PAH色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈和水作為流動相，以1.5 mL/min的流速進行梯度分離。梯度洗脫程序如下：50% ACN(0～5 min)，增加至100% ACN(5～20 min)，100% ACN(20～28 min)，降低至50% ACN(28～32 min)，50% ACN(32～36 min)。參考文獻[15-16]及國標中一些PAHs的最佳激發(fā)及發(fā)射波長，結(jié)合不同 PAHs保留時間的差異，優(yōu)化確定熒光檢測程序見表1，采用優(yōu)化后的條件，對比標準溶液、溶劑空白以及空白加標的 15種 PAHs的色譜圖，如圖3所示。

表1 熒光檢測程序

圖3 多環(huán)芳烴標準溶液(A)、溶劑空白(B)和空白加標(C)的HPLC-FLD色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 線性范圍

精密吸取一定體積的混合對照品儲備液，按倍數(shù)關(guān)系稀釋成不同質(zhì)量濃度的標準溶液進行測定，采用優(yōu)化后的前處理方法以及色譜條件，以15種多環(huán)芳烴濃度為橫坐標(x)，對應(yīng)的峰面積平均值為縱坐標(y)，繪制標準曲線；以信噪比S/N=3確定儀器檢出限(LOD)。結(jié)果如表2所示，15種多環(huán)芳烴在1～20 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.9990；定量限在0.011～0.76 μg/kg之間，檢出限在0.0032～0.23 μg/kg之間，方法靈敏度較高，可滿足糖品中多環(huán)芳烴檢測需要。

表2 線性、定量限、檢出限、精密度、重復(fù)性和回收率平均值

2.1.2 精密度試驗

取供試品溶液(加標10.0 μg/kg)按照1.3節(jié)色譜條件連續(xù)進樣 6次進行精密度試驗，表2結(jié)果顯示，15種多環(huán)芳烴峰面積的精密度為 2.0%～9.4%，表明儀器的精密度良好。

2.1.3 加標回收率

精確稱取紅糖樣品3.0 g，按重復(fù)性結(jié)果計算得到15種多環(huán)芳烴的含量，分別加入3個水平的對照品，在最佳提取條件及色譜條件下，每一濃度平行3次測定15種多環(huán)芳烴的回收率，結(jié)果見表2。15種多環(huán)芳烴的平均回收率為 72.3%～94.3%，能夠滿足15種多環(huán)芳烴檢測的需要。

2.2 15種多環(huán)芳烴的檢測結(jié)果

104個樣品的測定結(jié)果顯示(表3)，(美國)環(huán)境保護局(EPA)優(yōu)先污染物列表中確定的所有 16種多環(huán)芳烴有12種成分被檢出，其中，最大檢出量為 25.29 μg/kg。在 37.5%的樣本中，檢測到單個PAHs(Nap、Fln、Pyr)的含量＞1.0 μg/kg。Phe的中位值最高為 1.33 μg/kg，其次是 Fln(0.30 μg/kg)。而BaP的中位數(shù)低于檢出限，僅為0.027 μg/kg。由表3可知，食糖中的PAHs主要為三環(huán)和四環(huán)的PAHs，其中Fln、Phe的檢出率為100%，F(xiàn)lt、Pyr的檢出率次之，分別為99%和98.1%。

表3 糖品中15種多環(huán)芳烴的分析結(jié)果

注：＜LOD(%)為含量低于檢出限的個數(shù)(比例)。

2.3 不同食糖中的多環(huán)芳烴含量

表3顯示了不同食糖中單個多環(huán)芳烴的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)有11種多環(huán)芳烴在赤砂糖樣品中檢出，而且含量也比較高，而在其他大多數(shù)樣品中檢測到的濃度都很低。

表3顯示了 BaP、PAH2(BaP+CHR)、PAH4(BaP+CHR+BaA+BbF)、PAH8 (PAH4+BkF+DhA+BpE+InP)的總和。其中大部分樣品(88.5%)的 BaP含量均小于檢出限。PAH2、PAH4和PAH8最大值均小于1.0 μg/kg(歐盟的最低限量值)。其中BaA、DhA 在赤砂糖中檢測到最大值，為 0.16 μg/kg，86.5%的BaA含量大于檢出限，提示它是影響食糖PAHs風(fēng)險值比較大的因素。與BaP和PAH2相比，PAH4和PAH8可以更好地表明遺傳毒性和致癌性PAH的發(fā)生和毒性。但是與PAH4相比，檢測PAH8的數(shù)量不會提供太多附加值，因為從數(shù)據(jù)上看PAH8的檢出率并沒有增加多少。此外，PAH8中的4個附加PAH(與PAH4相比)不太相關(guān)，因為他們在食品中并不常見。

相關(guān)文獻提供了不同的測定結(jié)果。在巴西，報告了 57%的食糖樣品中檢測到多環(huán)芳烴，總含量小于 1.35 μg/kg。其中 51%的糖樣品中檢出苯并[a]蒽，而在所有樣品中均未檢測到二苯并[a,h]蒽[11]。在95%的巴西原糖樣品中檢測到多環(huán)芳烴，總量小于4.03 μg/kg。其中含量最高的是芘，占樣品總量的 67%，其次是蒽，占 48%。所有樣品中均未檢測到萘、苊烯、芴和茚并[1,2,3-c,d]芘[9]。另有研究者對40份甘蔗汁樣品進行了檢測，發(fā)現(xiàn)有4個普通樣品和甘蔗收割期的樣品中有12個樣品的PAHs含量超過檢出限，分別為0.006～0.021 μg/kg 和 0.008～0.290 μg/kg。其中最具代表的多環(huán)芳烴是苯并[b]熒蒽，約 30%的樣品中有檢出。而苯并[k]熒蒽則在任何分析樣品中均未檢測到[17]。

Camargo和 Toledo進行的一項研究中，9個白糖樣品中5種多環(huán)芳烴(苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘和二苯并[a,h]蒽)的平均總和水平為6.15 μg/kg，其中二苯并[a,h]蒽的含量最高為5.17 μg/kg。有報道稱白糖和紅糖中PAHs的總和水平有明顯的差異，這種差異可能與 2個因素有關(guān)：①加工過程中的差異：白糖在生產(chǎn)加工過程中經(jīng)過清凈工藝，降低了產(chǎn)品中的 PAHs水平[18]，而紅糖沒有經(jīng)過高度精煉，幾乎保留了蔗汁中的全部成分；②使用的甘蔗類型(燒過或沒有焚燒)的差異：甘蔗作物在收獲前被焚燒時，是多環(huán)芳烴(PAHs)排放的重要來源[17]。

2.4 風(fēng)險評估

對于遺傳毒性和致癌性污染物的風(fēng)險評估，食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)和歐洲食品安全局(EFSA)都建議使用暴露裕度(MOE)方法?；贓FSA確定的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，以BaP、PAH2、PAH4和PAH8 4個替代指標物具有10%額外腫瘤發(fā)生風(fēng)險的 95%置信區(qū)間下限值(BMDL10)作為 PAHs混合物的致癌效應(yīng)參考點，分別為0.07、0.17、0.34和 0.49 mg/(kg·d)[19]。

MOE值計算見公式：

MOE=BMDL10/每日膳食暴露量

依據(jù)公式為：

其中：Yi為每人每日膳食食糖中 PAHs暴露量[ng/(kg·d)]；Xi為每人每日膳食食糖消費量(g/d)；Ci為膳食食糖中 PAHs的含量(ug/kg)；Wi為體重(kg)。

PAHs含量(Ci)分別選取 BaP、PAH2、PAH4、PAH8含量的平均值、P50以及P953個統(tǒng)計參考點值(見表4)；居民食糖消費量(Xi)數(shù)據(jù)使用2015/16年榨季我國人均食糖消費量[20]及參考體重為 60 kg。暴露定量風(fēng)險評估居民每日膳食食糖PAHs暴露量評估結(jié)果見表5，致癌風(fēng)險評估結(jié)果見表6。結(jié)果顯示在平均暴露水平(均值和P50值)以及高暴露水平(P95值)時的MOE值均遠大于10000，健康風(fēng)險較低。EFSA提到，對于普通消費者來說，當MOE值遠大于10000時，表明對消費者健康的影響程度較低[19]。

表4 食糖中BaP、PAH2、PAH4及PAH8含量(n=90)

表5 我國居民食糖中多環(huán)芳烴暴露量評估結(jié)果

表6 我國居民食糖中多環(huán)芳烴致癌風(fēng)險評估的暴露限值

3 結(jié)論

本研究用正己烷∶二氯甲烷(1∶1)提取樣品后，采用Cleanert Florisil凈化，凈化后的樣品進行HPLC-FLD檢測。結(jié)果表明，食糖中15種PAHs的加標回收率為 72.3%～94.3%，RSD為 2.0%～9.4%，該方法高效、快速、靈敏度高，可以用于食糖中15種PAHs的定量分析。104個食糖樣品均檢出含有多環(huán)芳烴。檢出次數(shù)最多的成分為芴、菲、熒蒽和芘。在所有樣品中，BaP、PAH2、PAH4、PAH8的含量均小于l.0 μg/kg，并且MOE值均遠大于10000，這些結(jié)果表明對消費者健康的影響程度較低，本研究為定量評價食糖污染的生態(tài)風(fēng)險、保障食品安全質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。