基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究荷葉堿對(duì)多囊卵巢綜合征的作用機(jī)制※

張靖悅 趙恒俠 陳宇陽(yáng) 連李榮

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院2019級(jí)碩士研究生，廣東 深圳 518033)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期女性常見(jiàn)的以高雄激素及持續(xù)無(wú)排卵或排卵障礙為特征的內(nèi)分泌代謝異常的疾病，長(zhǎng)期可導(dǎo)致生殖功能障礙，增加子宮內(nèi)膜癌、心腦血管等疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前，PCOS發(fā)病機(jī)制尚不明確，胰島素抵抗、低度炎性反應(yīng)等與PCOS的發(fā)生相關(guān)[2]。西醫(yī)治療PCOS常對(duì)癥予促排卵、調(diào)節(jié)月經(jīng)周期、增加胰島素敏感性等，但效果一般且有毒副作用[3]。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，防治PCOS有一定優(yōu)勢(shì)。趙恒俠教授認(rèn)為，痰濁阻滯為PCOS發(fā)病的主要病機(jī)，以輕清荷葉為君藥，自擬“荷芪散(主要藥物：荷葉、黃芪、蒼術(shù)、香附、郁金、決明子等)”健脾除濕、升清降濁治療PCOS。前期實(shí)驗(yàn)及臨床觀察證實(shí)，荷芪散具有改善PCOS大鼠及PCOS患者胰島素抵抗、糖脂代謝，糾正性激素紊亂等作用，但缺少方中中藥單體作用機(jī)制的研究[4-6]。

荷葉的有效成分主要包括生物堿類(lèi)及黃酮類(lèi)等[7-8]，其中荷葉堿為荷葉中富含的一種異喹啉類(lèi)生物堿，是荷葉發(fā)揮藥理作用的重要成分。目前研究證明，荷葉堿可減輕體質(zhì)量，改善胰島素抵抗[9]，減緩炎性反應(yīng)[10]，因此推測(cè)荷葉堿可通過(guò)提高胰島素敏感性及干預(yù)炎性反應(yīng)起到治療PCOS的作用。但荷葉堿作用靶點(diǎn)及通路眾多，傳統(tǒng)藥理學(xué)研究思維方法單一，難以進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以生物信息學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)等學(xué)科為基礎(chǔ)，通過(guò)建立“成分-靶點(diǎn)-疾病”模型，全面、系統(tǒng)、多維度分析藥物作用的潛在分子機(jī)制，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用[11]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究荷葉堿對(duì)PCOS的作用靶點(diǎn)及通路，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 荷葉堿結(jié)構(gòu)及作用靶點(diǎn)獲取 ①利用Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)以“Nuciferin“為關(guān)鍵詞檢索獲取荷葉堿的3D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch)得到荷葉堿的相關(guān)靶點(diǎn)；②利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)以“Nuciferin”為關(guān)鍵詞，檢索項(xiàng)為“Chemical Name”進(jìn)行檢索，獲取荷葉堿的靶點(diǎn)。將上述2個(gè)來(lái)源的靶點(diǎn)匯總?cè)ブ睾蟮玫胶扇~堿的相關(guān)靶點(diǎn)，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org)將靶點(diǎn)名稱(chēng)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 PCOS疾病靶點(diǎn)獲取 在GeenCard數(shù)據(jù)庫(kù)(The Human Gene Database，http://www.genecards.org)、OMMI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org)輸入“polycystic ovary syndrome”檢索，獲得PCOS的疾病相關(guān)靶點(diǎn)，匯總?cè)ブ睾罄肬niprot數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范靶點(diǎn)。

1.3 成分-疾病共同靶點(diǎn)篩選 借助Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具將1.1項(xiàng)中獲得的荷葉堿相關(guān)靶點(diǎn)與1.2項(xiàng)中獲得的PCOS疾病靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，取交集，并借助Venny 2.1.0在線工具繪制Venn圖，利用Cytoscape軟件建立“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 荷葉堿治療PCOS靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將1.3項(xiàng)中獲得的荷葉堿與PCOS疾病共同靶點(diǎn)基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo sapiens”，隱藏游離位點(diǎn)，其余默認(rèn)選項(xiàng)，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape 3.8.1的Network Analyzer功能分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，得到主要靶點(diǎn)并可視化。運(yùn)用R語(yǔ)言軟件繪制度(Degree)值前30位靶點(diǎn)(即核心靶點(diǎn))的柱狀圖。

1.5 基因本體(gene ontology，GO) 功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)(kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 利用R軟件的ClusterProfiler包將荷葉堿與PCOS的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析以描述基因靶點(diǎn)的功能，包括生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組成(cellular component，CC)，并對(duì)交集基因進(jìn)行KEGG通路富集分析以探討荷葉堿作用的信號(hào)通路。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析均以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并用微生信平臺(tái)繪制條形圖，根據(jù)富集分析結(jié)果進(jìn)一步探究荷葉堿治療PCOS的分子機(jī)制。

1.6 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接 通過(guò)TCMSP下載荷葉堿結(jié)構(gòu)的mol2格式文件，使用AutoDock對(duì)其進(jìn)行加氫、加電子等修飾操作，以pdbqt文件格式輸出，利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org)獲取核心靶點(diǎn)蛋白3D結(jié)構(gòu)的pdb格式文件，使用AutoDock軟件去水、加氫、加電子后輸出pdbqt格式文件，最后使用AutoDock對(duì)以上蛋白進(jìn)行分子對(duì)接并獲得相應(yīng)結(jié)合能(binding energy，BE)，并利用Pymol軟件將結(jié)果進(jìn)行可視化。通過(guò)BE評(píng)價(jià)靶點(diǎn)與蛋白之間的結(jié)合活性，BE越低，結(jié)合活性越大，發(fā)生作用可能性越大。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)獲取結(jié)果 通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)及TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索荷葉堿有效靶點(diǎn)，匯總?cè)ブ睾蠊驳玫?3個(gè)靶點(diǎn)，利用GeenCard數(shù)據(jù)庫(kù)和OMMI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索PCOS疾病靶點(diǎn)，匯總?cè)ブ睾蠊驳玫?575個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 成分-疾病共同靶點(diǎn)篩選結(jié)果 將2.1項(xiàng)中獲得的荷葉堿靶點(diǎn)與PCOS疾病靶點(diǎn)比對(duì)取交集后得到交集靶點(diǎn)36個(gè)，推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是荷葉堿治療PCOS的潛在靶點(diǎn)，見(jiàn)表1、圖1；“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。

表1 荷葉堿治療PCOS潛在靶點(diǎn)

圖1 荷葉堿-PCOS交集靶點(diǎn)Venn圖

圖2 “成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 荷葉堿治療PCOS靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 3.8.1可視化，生成荷葉堿治療PCOS靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。PPI網(wǎng)絡(luò)中除去游離靶點(diǎn)DDP4、NR4A1、FDFT1，共得到33個(gè)節(jié)點(diǎn)，146條邊，其中節(jié)點(diǎn)圖標(biāo)越大，顏色越深接近墨綠色則在網(wǎng)絡(luò)中作用越大，邊越粗表明相互作用關(guān)系越強(qiáng)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鍪荆W(wǎng)絡(luò)平均度值為8.11，度值越高，表明越傾向?yàn)殛P(guān)鍵蛋白，度值排名前30的靶點(diǎn)繪制核心靶點(diǎn)基因條形圖(見(jiàn)圖4)，推測(cè)SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3為荷葉堿治療PCOS的核心靶點(diǎn)。

圖3 荷葉堿治療PCOS靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心靶點(diǎn)基因度值條形圖

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果 GO功能富集分析共獲得1230個(gè)條目，其中MF 77個(gè)，包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、蛋白激酶活性、氧化還原酶活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、核受體結(jié)合、整合素結(jié)合等；BP 1115個(gè)，包括對(duì)激素的反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、對(duì)缺氧的反應(yīng)等；CC 38個(gè)，包括質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體、髓鞘、囊泡腔、線粒體外膜、質(zhì)膜外側(cè)等，按照-lgP值由大到小排序，對(duì)排名前10位的條目進(jìn)行展示，見(jiàn)圖5。KEGG通路富集分析共得到149條通路(P<0.05)，涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse)、鈣信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)、多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse)、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)，按-lgP值由大到小排序，對(duì)排名前20的通路進(jìn)行展示，見(jiàn)圖6。

圖5 GO功能富集分析條形圖

圖6 KEGG通路富集分析條形圖

2.5 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果 將荷葉堿活性成分與SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3 5個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，見(jiàn)表2、圖7。結(jié)果顯示，荷葉堿與上述5種核心靶點(diǎn)蛋白均能良好結(jié)合。

表2 核心靶點(diǎn)與荷葉堿分子對(duì)接結(jié)果

圖7 SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3與荷葉堿分子對(duì)接圖

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理的方法，對(duì)荷葉堿治療PCOS進(jìn)行系統(tǒng)全面的研究。結(jié)果顯示，荷葉堿治療PCOS的潛在靶點(diǎn)有36個(gè)，SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3為荷葉堿治療PCOS的核心靶點(diǎn)，可能通過(guò)5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸等發(fā)揮作用。分子對(duì)接研究結(jié)果表明，荷葉堿與SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3靶點(diǎn)的BE均小于-5 kcal/mol，均可生成氫鍵，說(shuō)明其與潛在靶點(diǎn)的結(jié)合性較高，因此推測(cè)，荷葉堿未來(lái)可能成為治療PCOS的有效化合物之一，可為新藥的研發(fā)提供新思路。

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是單胺類(lèi)化合物，又稱(chēng)血清素，主要由腸嗜鉻細(xì)胞合成，作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于大腦皮層及神經(jīng)突觸內(nèi)[12]。隨著研究的不斷進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)5-HT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外的許多系統(tǒng)如內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)等皆發(fā)揮著重要作用[12]。視前區(qū)(POA)和內(nèi)側(cè)基底下丘腦(MBH)控制排卵期前黃體生成激素(LH)和排卵數(shù)量的增加，而POA和MBA受來(lái)自腦干下部5-HT分泌的影響[13]。Maekawa F等[14]研究表明，位于腦干的中縫背核在誘導(dǎo)LH峰和排卵中起重要作用，5-HT受體系統(tǒng)參與了這一機(jī)制。唐怡等[15]和王建紅等[16]研究表明，慢性刺激使5-HT含量下降，雌性鼠的促性腺激素釋放激素(GnRH)含量亦下降。因此，5-HT與性激素分泌及女性排卵有一定相關(guān)性。

多巴胺(DA)系統(tǒng)是維持GnRH和LH基礎(chǔ)分泌的重要因素。現(xiàn)有研究認(rèn)為，可能由于體內(nèi)類(lèi)固醇激素水平的不同，DA對(duì)GnRH的釋放有雙向調(diào)控作用，即雌激素水平高時(shí)抑制GnRH的分泌，雌激素水平低時(shí)促進(jìn)GnRH的分泌。PCOS患者表現(xiàn)為高雄激素血癥，較高水平的雄激素在芳香化酶的作用下轉(zhuǎn)化為較多的雌二醇和雌酮，因此多數(shù)研究認(rèn)為，DA對(duì)PCOS患者GnRH有較強(qiáng)的抑制作用。國(guó)內(nèi)外許多研究表明，PCOS患者表現(xiàn)為中樞性DA減少，從而引起LH異常分泌[18-19]。此外，PCOS患者多合并肥胖，而5-HT和DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)可通過(guò)調(diào)節(jié)食欲改善肥胖[20]。5-HT影響肝臟局部的脂質(zhì)儲(chǔ)存，而不影響全身能量平衡[21]。5-HT還被發(fā)現(xiàn)通過(guò)HTR2A在脂肪組織中誘導(dǎo)脂肪生成[22]。DA作用的發(fā)揮很大程度上受3種酶COMT、MAOA和MAOB以及SLC6A3控制[23]。其中，MAOA還有平衡大腦中5-HT分泌的作用[24]。Need A C等[23]在一項(xiàng)研究對(duì)象均為女性的研究中發(fā)現(xiàn)，MAOA基因型與體質(zhì)量和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)均顯著相關(guān)，MAOA在肥胖者中表現(xiàn)為過(guò)量的低活性基因型。DRD2多態(tài)性亦與體質(zhì)量相關(guān)[25]。

OPRM1是阿片類(lèi)受體，廣泛存在于大腦和機(jī)體的其他外周組織中。內(nèi)源性阿片肽作為下丘腦GnRH分泌的抑制性調(diào)節(jié)劑，對(duì)卵巢功能有著重要的影響[26]。阿片類(lèi)藥物活性升高在高雄激素血癥、高胰島素血癥的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，長(zhǎng)期阿片受體阻斷治療可以使高雄激素血癥婦女的高胰島素血癥恢復(fù)正常[27]。內(nèi)源性阿片類(lèi)受體參與改善運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的胰島素抵抗，外周阿片類(lèi)受體激活有助于改善受損的受體后胰島素信號(hào)通路[28]。因此，推測(cè)OPRM1可以改善PCOS患者高雄激素血癥以及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

綜上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法證實(shí)了荷葉堿通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路治療PCOS，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)的核心靶點(diǎn)與荷葉堿進(jìn)行分子對(duì)接均有良好的結(jié)合活性，結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道相吻合。進(jìn)一步證明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的可靠性，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供了理論參考依據(jù)。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可能存在疾病、藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)信息不全等不足，因此仍需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)健全完善精度更高的中藥挖掘技術(shù)。