• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    紅樹林土壤中假單胞菌群的重金屬耐受活性*

    2021-02-12 10:44:20黃庶識蘇芯瑩覃仙玲
    廣西科學(xué) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:株菌菌體單胞菌

    李 菲,李 喆,黃庶識,蘇芯瑩,覃仙玲**

    (1.廣西科學(xué)院,廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530007;2.廣西科學(xué)院,廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530007)

    0 引言

    目前,我國耕地土壤重金屬污染形勢嚴(yán)峻,污染面積大,且污染重金屬種類多、含量高,全國重金屬污染耕地約2 000 hm2,約占全國總耕地面積的16.7%,部分污染嚴(yán)重的耕地,重金屬含量可高達(dá)安全限值的100倍[1]。重金屬污染物的生物毒性大,易與化肥、農(nóng)藥以及抗生素等有機(jī)物結(jié)合,生成更具毒性的有機(jī)金屬化合物,極大影響并危害生物體正常生長。再者,重金屬污染物吸附在土壤顆粒上,既降低土壤微生物活性、抑制植物根系對營養(yǎng)元素吸收,也極易被農(nóng)作物吸收富集[2,3]?;谥亟饘傥廴疚锏倪w移、富集特性,生物體中的重金屬濃度可能倍增至生境中的上萬倍,而重金屬沿食物鏈逐級進(jìn)入人體內(nèi)并長期富集積累后,會對人體產(chǎn)生巨大危害,如鉛污染會對人體的造血、神經(jīng)和消化系統(tǒng)有較明顯傷害[4],會導(dǎo)致人體四肢酸痛、貧血、神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性疾病、肝/腎損傷、心血管器質(zhì)性疾病、智力下降(特別是兒童)及中樞神經(jīng)和造血系統(tǒng)的損傷等[5];鎘污染可能會導(dǎo)致人體的消化系統(tǒng)遭受破壞,腎、肝功能失調(diào),骨質(zhì)疏松,人體器官致癌致畸[6];六價(jià)鉻污染會損傷人體呼吸系統(tǒng),破壞人體細(xì)胞中DNA致使細(xì)胞畸變[7];銅污染會使人體出現(xiàn)惡心、嘔吐、胃燒灼感等癥狀,重者會出現(xiàn)腹痛、吐血、溶血性黃疸、貧血、肝大、血紅蛋白尿、急性腎功能衰竭和尿毒癥[7];人類食用鈷污染的食品,輕者脫發(fā),重者會引起血液系統(tǒng)疾病[8]。

    修復(fù)重金屬污染的耕地土壤,能有效地將污染源遏制在食物鏈最底端,其主要途徑有去除化和固定(或穩(wěn)定)化。去除化是將土壤中的重金屬污染物提取出去;固定(或穩(wěn)定)化是改變土壤中重金屬的存在形態(tài),以消除生物毒性[9]。其中,微生物修復(fù)作為固定(或穩(wěn)定)化技術(shù)中的研究熱點(diǎn),主要是利用微生物對重金屬的親合、吸附、轉(zhuǎn)化效應(yīng),降低土壤中重金屬的有效濃度。微生物治理法具有成本低、效率高,一般不需要停耕,可進(jìn)行原位修復(fù),能改善土壤環(huán)境、提升土壤肥力等優(yōu)勢;但該方法同時(shí)具有對重金屬固定性有限、代謝能力不佳、微生物流失或被吞噬等缺點(diǎn)[1,10,11]。因此,尋找耐受力強(qiáng)、適用范圍廣的微生物類型,可對微生物在實(shí)際應(yīng)用中的強(qiáng)化和聯(lián)合修復(fù)工作提供更好的幫助。

    假單胞菌群是一類活躍在植物根際的革蘭氏陰性菌,能產(chǎn)生多種抗生素,改善植物營養(yǎng),促進(jìn)植物生長,降解土壤中有毒物質(zhì)及起防病殺蟲作用等[12]。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn),熒光銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaCW-96-1在有氧培養(yǎng)過程中,可以通過沉淀硫化鎘去除溶液中99%以上的Cd2+。Pramanik等[14]發(fā)現(xiàn)一株P(guān)seudomonassp.K32對Cd2+、Pb2+和As3+高度耐受,在Cd2+脅迫下表現(xiàn)出固氮和溶磷能力且能產(chǎn)生生長素IAA,促進(jìn)水稻(Oryzasativa)幼苗生長,同時(shí),對多種植物病原真菌有顯著抑制作用及產(chǎn)生大量的功能酶。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)生PseudomonasputidaRE02可定植在白三葉(Trifoliumrepens)根際和根內(nèi),對鎘、鉻和鉛金屬高度耐受,且能促進(jìn)植物發(fā)芽,提高土壤肥力。Mokrani等[16]研究發(fā)現(xiàn),兩株固氮假單胞菌Pseudomonasazotoformans對Cd2+和Pb2+有很強(qiáng)耐受性,且能拮抗多種植物病原菌。此外,鑒于紅樹林處于海水與淡水交互的特殊地帶,其沉積物中富含有機(jī)質(zhì),且具有一定的厭氧性和還原性,進(jìn)而可以結(jié)合更多的重金屬,使其成為重金屬污染物的“匯”[17]。故本研究從紅樹林土壤中分離假單胞菌群,并對其開展重金屬耐受活性研究,旨在獲得對多種重金屬都有高耐受活性的菌株,并檢測菌株的修復(fù)能力,為微生物修復(fù)技術(shù)研究提供數(shù)據(jù)參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 紅樹林土壤樣本

    2021年8月初從廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)(108°36′14″ E,21°44′53″ N)中采集3處土壤樣本,待潮水退至最低潮時(shí),從最靠近海端的紅樹林往回隨機(jī)采集(每處間隔5 m),樣品采集深度為0.5 m,將樣品均裝于密封袋,于4℃低溫保藏備用。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    (1)分離/純化培養(yǎng)基:2216E固體培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物有限公司);改良ISP2固體培養(yǎng)基(麥芽提取粉2.0 g,酵母提取粉2.0 g,葡萄糖2.0 g,去離子水1 000 mL,海鹽25.0 g,瓊脂14.0 g)。

    (2)重金屬耐受實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基:改良ISP2培養(yǎng)基,BE培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0 g,去離子水1 000 mL)。分別用去離子水配制6 400 μg/mL的CoCl2、ZnSO4、CdSO4、CuSO4、Pb(NO3)2和K2Cr2O7溶液,無菌過濾后即為重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株分離純化

    稱取2.0 g混合樣品裝于20 mL無菌海水(添加1%的吐溫20),180 r/min搖床處理30 min后,稀釋成10-2和10-3濃度的樣液備用。取200 μL稀釋的樣液涂布至2216E固體培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)7 d,挑取肉眼可見菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),記錄其形態(tài)特征和菌落數(shù),以30% (V/V)甘油-ISP2混合液作為保護(hù)劑,將純化好的菌株制成凍存管保藏于-70℃冰箱。

    1.2.2 16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

    采用chelex-100樹脂[18]快速提取細(xì)菌的DNA作為PCR模板,并根據(jù)Walsh等[19]的方法對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增和測序引物均為細(xì)菌通用引物27F和1492R,PCR反應(yīng)條件參照李菲等[20]的方法設(shè)定。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor軟件整理后,利用EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(https://www.ezbiocloud.net/)進(jìn)行在線比對[21];選取同源性最高菌株的序列作為參比對象,運(yùn)用MEGA 10.0軟件,采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Boostrap 1 000次檢測各分支的置信值,對各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析[22]。

    1.2.3 重金屬耐受菌的初篩

    以改良ISP2或BE固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加6種重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液使其終濃度為100 μg/mL,將待測菌株劃線于該培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)5 d,觀察其生長狀況,并記錄其結(jié)果。

    1.2.4 耐受菌的重金屬離子最大耐受濃度

    根據(jù)肉湯稀釋法[23]測定重金屬離子抑制待測菌株的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC),即細(xì)菌對重金屬最大耐受濃度。各取60 μL重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別加入96孔板的第1列,加入60 μL改良ISP2或EB(Pb2+)液體培養(yǎng)基,混合均勻后,吸取60 μL混合液至第2列孔內(nèi),再加入60 μL改良ISP2或EB(Pb2+)液體培養(yǎng)基,混合均勻后,吸取60 μL混合液至第3列孔內(nèi),以此類推,稀釋至第6列孔內(nèi)。第1至第6列的重金屬離子濃度依次為3 200,1 600,800,400,200及100 μg/mL,第7列加60 μL改良ISP2或EB(Pb2+)液體培養(yǎng)基作為陽性對照,以各濃度下的重金屬離子溶液(不加菌)作為陰性對照,每組3個(gè)平行。用麥?zhǔn)媳葷峁軐⒋嚲甑木鷳乙簼舛日{(diào)至約108CFU/mL,分別加入第1至第7列96孔板中。28℃培養(yǎng)5 d,用酶標(biāo)儀測定其OD600值。

    1.2.5 菌株的重金屬耐受基因檢測

    采用1.2.2節(jié)的方法提取細(xì)菌中的DNA,對重金屬耐受基因進(jìn)行擴(kuò)增,退火溫度均設(shè)置為58℃,參數(shù)[24,25]詳見表1。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。

    表1 假單胞菌的重金屬耐受基因檢測引物

    1.2.6 菌株對重金屬離子的吸附能力

    取活性顯著對數(shù)生長期菌株分別接種至100 mL改良ISP2培養(yǎng)基中,置于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2-3 d,用紫外分光光度計(jì)測定培養(yǎng)物的OD600值,待其OD600值趨于穩(wěn)定,用無菌離心管收集全部菌體,8 000 r/min離心10 min,棄上清液,收集菌體沉淀,用無菌水洗滌3次,用0.9%生理鹽水重懸菌體后置于4℃冰箱中保存14-16 h,即可得到休止細(xì)胞溶液。將休止細(xì)胞溶液置于50 mL離心管(設(shè)置3組平行),5 000 r/min離心5 min,收集菌體沉淀,稱量濕菌體重量,再用已配制好的重金屬離子溶液重懸菌體,重金屬離子終濃度為400 mg/L,28℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。以接種前的重金屬離子溶液作為對照組,用原子吸收光譜儀測定重金屬離子濃度,并計(jì)算其吸附率和吸附能力,公式:吸附率=(對照組重金屬離子濃度-實(shí)驗(yàn)組重金屬離子濃度)/空白組重金屬離子濃度×100%;吸附能力=溶液體積×(對照組重金屬離子濃度-實(shí)驗(yàn)組重金屬離子濃度)/細(xì)胞干重,單位為mg金屬/g菌體。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 紅樹林土壤中可培養(yǎng)假單胞菌

    從廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)土壤中共獲得77株細(xì)菌,通過形態(tài)、大小、顏色等形態(tài)學(xué)特征及革蘭氏染色進(jìn)行初步排重,選取42株革蘭氏陰性菌進(jìn)行16S rRNA基因測序,結(jié)果共獲得23株假單胞菌,并對其構(gòu)建Neighbour-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。

    圖1 土壤中假單胞菌的16S rRNA基因序列N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

    2.2 假單胞菌的重金屬耐受活性初篩結(jié)果

    23株假單胞菌在各重金屬培養(yǎng)基上生長情況如下:能在含100 μg/mL Cu2+,Pb2+,Cr6+,Cd2+,Co2+和Zn2+培養(yǎng)基上生長的假單胞菌分別有16,18,14,10,4和15株;總陽性率分別為69.56%,78.26%,60.87%,43.48%,17.39%和65.22%。其中,Y390,Y193和Y122均不能在各重金屬培養(yǎng)基上生長;Y123,Y225,Y167和Y150均在含Co2+培養(yǎng)基上長出少量菌落;Y286和Y336均在含Pb2+和Cr6+培養(yǎng)基上長出少量菌落,在其他重金屬培養(yǎng)基上未見菌苔。此外,重金屬培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)發(fā)生了變化,如Cu2+培養(yǎng)基上,Y234的菌體顏色由淺棕色變?yōu)闇\綠色,Y272的菌體顏色由微橙色變?yōu)楹稚?,且菌體表面較為干燥;Pb2+培養(yǎng)基上,Y234和Y167的菌體變?yōu)槌壬?,Y272的菌體變?yōu)樯詈稚?圖2)。

    圖2 4株菌在各重金屬培養(yǎng)基上的生長情況

    2.3 菌株的重金屬耐受性能

    根據(jù)初篩結(jié)果,選出至少能在一種含有100 μg/mL重金屬培養(yǎng)基上生長的假單胞菌18株,進(jìn)一步摸索各菌株在不同重金屬離子中最大耐受濃度。由表2可知,可耐受800 μg/mL Pb2+的菌株有7株,4株菌對Pb2+的耐受活性可達(dá)1 600 μg/mL;耐受Zn2+的假單胞菌有6株,耐受Zn2+濃度在1 600 μg/mL以上;其中,有6株菌對Pb2+和Zn2+均有顯著耐受活性,分別為Y234、Y123、Y225、Y167、Y346和Y264。除此之外,對鉛和/或鋅耐受活性顯著的11株菌對其他多種重金屬,如Cu2+、Cr6+和Cd2+,也具有一定的耐受性,這可能與其生長的紅樹林生境有關(guān)。生活在被污染土壤中的微生物往往會通過改變自身的生化和結(jié)構(gòu)特征、生理特性和遺傳基因等來適應(yīng)環(huán)境,從而產(chǎn)生各種機(jī)制應(yīng)對各種復(fù)雜的環(huán)境[26],這一特性暗示這些菌株對多種重金屬復(fù)合污染的水體具有修復(fù)潛能。

    對23株假單胞菌進(jìn)行重金屬抗性基因檢測(表2和圖3),最常見的基因是copB(21.74%)、copA(26.09%)、czcA(13.04%)和chrR(4.35%),其中copA和copB基因與銅的抗性有關(guān),czcA基因與鎘、鋅和鈷的抗性有關(guān),chrR基因與鉻的抗性有關(guān)。綜合對假單胞菌在重金屬培養(yǎng)基上生長及攜帶重金屬抗性基因分析可知,在9株顯示copA和/或copB基因的菌株中,有7株表現(xiàn)出MIC (Cu2+)≥200 μg/mL。在不含copA或copB基因的14株菌中,有4株菌的MIC (Cu2+)≥200 μg/mL,3株菌的MIC(Cu2+)=100 μg/mL。23株假單胞菌中有3株檢測出czcA基因,其MIC (Zn2+)≥1 600 μg/mL;其余未檢出czcA的假單胞菌中,MIC (Zn2+)≥1 600 μg/mL的有3株,有3株菌的MIC (Zn2+)=200 μg/mL;23株假單胞菌對鎘和鈷的抗性均不顯著,MIC (Cd2+)≤400 μg/mL,MIC (Co2+)≤100 μg/mL。chrR基因僅在Y302中檢測到,其MIC (Cr6+)=100 μg/mL,其余未檢測出chrR基因的菌株中,有13株菌對Cr6+有一定的耐受性,其MIC (Cr6+)=100-200 μg/mL。

    表2 18株假單胞菌的重金屬耐受活性

    1-11號孔依次表示Marker,Y105,Y302,Y118,Y234,Y225,Y307,Y297,Y272,Y150和Y264。7條Marker指示帶從上至下表示2 000,1 000,750,500,250和100 bp

    2.4 菌株對重金屬離子的吸附能力

    選擇11株對鉛和/或鋅有耐受表征的假單胞菌進(jìn)行吸附性能測試,在排除明顯的儀器導(dǎo)致的測試誤差后,獲得5株顯著吸附Pb2+和/或Zn2+的菌株(圖4)。其中,鉛的吸附率排序?yàn)閅234>Y346>Y123>Y264>Y225,鉛吸附能力排序?yàn)閅346>Y234>Y123>Y225>Y264;鋅的吸附率排序?yàn)閅123>Y264>Y234>Y225>Y346,鋅吸附能力排序?yàn)閅123>Y234>Y264>Y225>Y346。其余6株菌株對富含Pb2+和/或Zn2+的溶液基本無去除作用(吸附率均在10%以下)。吸附能力是指生物體的吸附量,在相同的菌體質(zhì)量下,Y346對鉛的吸附量最大,其吸附能力最好;Y123對鋅的吸附量最大且吸附率最高,其吸附能力最強(qiáng)。

    圖4 5株顯著活性菌株的吸附性能

    3 討論

    紅樹林微生物群落經(jīng)過長時(shí)間進(jìn)化,形成了特殊的生理代謝系統(tǒng),在適應(yīng)生態(tài)環(huán)境與自我保護(hù)的同時(shí),通過通信、覓食等行為機(jī)制來適應(yīng)特殊環(huán)境,如鹽脅迫、高礦物質(zhì)組成、強(qiáng)還原性、強(qiáng)酸性、強(qiáng)風(fēng)、強(qiáng)流、徑流、高溫、強(qiáng)輻射、頻繁的潮汐、缺氧污泥和寡營養(yǎng)等。獨(dú)特的生境必然會造成其微生物具有獨(dú)特的生物活性[27]。本研究選取廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)內(nèi)土壤作為研究對象,從中共獲得23株假單胞菌,其中有18株菌能在多種重金屬培養(yǎng)基上生長,11株菌對鉛和/或鋅的耐受性顯著,5株菌對鉛和/或鋅的吸附能力突出。

    耐受基因檢測中,部分菌株檢測出重金屬耐受基因,但其在高濃度重金屬培養(yǎng)基上卻無法生長,如檢測出copA或copB基因的菌株Y307和Y118,其對銅的耐受濃度僅為100 μg/mL;部分檢測出czcA基因的菌株對鎘和鈷的耐受性差。究其原因,可能是在發(fā)酵條件下,大部分微生物基因簇是沉默的,后續(xù)實(shí)驗(yàn)將通過改變培養(yǎng)條件,如培養(yǎng)基成分、溫度、鹽度、pH、混合培養(yǎng)及表觀遺傳修飾劑等[28],激活微生物中的沉默基因簇,從而使之表現(xiàn)出較高的重金屬耐受性。然而,部分菌株雖然未檢出耐受基因,但是在重金屬培養(yǎng)基上仍表現(xiàn)出很好的耐受活性,如Y123和Y346,其耐受基因可能存在于細(xì)胞質(zhì)粒中。

    吸附能力實(shí)驗(yàn)中,有5株假單胞菌表現(xiàn)出良好的鉛和/或鋅吸附性能,鉛和/或鋅的吸附率分別為44.15%-75.20%和39.55%-82.38%,吸附能力分別為12.35-20.76 mg金屬/g菌體和9.58-20.79 mg金屬/g菌體。其中,銅綠假單胞菌Y234具有很強(qiáng)的重金屬吸附能力,這與許多報(bào)道的結(jié)論一致[23,24,29],但因其是條件致病菌,且感染免疫力低下人群,易具有多重耐藥性及難治療等因素,因此難以廣泛應(yīng)用于修復(fù)重金屬污染的環(huán)境。重金屬固定細(xì)菌是通過固定鈍化土壤/溶液中的重金屬,減少重金屬總量或者有效態(tài)含量,其作用機(jī)制主要有細(xì)胞壁吸附[30,31]、表面絡(luò)合[32]、細(xì)胞內(nèi)富集[33]和胞外沉淀[34]等。后續(xù)將對4株吸附能力好的假單胞菌開展掃描電鏡-能譜觀察、傅里葉紅外光譜及X衍射分析,以研究其作用機(jī)理,為更好地開展修復(fù)重金屬污染環(huán)境工作做準(zhǔn)備。

    4 結(jié)論

    廣西欽州茅尾海紅樹林保護(hù)區(qū)內(nèi)土壤富含假單胞菌群資源,且部分菌株的重金屬耐受活性顯著。其中,菌株Y234、Y123、Y264、Y225和Y346對重金屬鋅和/或鉛表現(xiàn)出良好的吸附特性,在降解有毒物質(zhì)和改善植物微環(huán)境方面具有較大潛力。

    猜你喜歡
    株菌菌體單胞菌
    菌體蛋白精養(yǎng)花鰱高產(chǎn)技術(shù)探析
    東北酸菜發(fā)酵過程中菌體的分離與鑒定
    卷柏素對唑類藥物體外抗念株菌的增效作用
    3株耐鹽細(xì)菌對萘、菲、惹烯和苯并[α]芘的降解性能
    槲皮素改善大鼠銅綠假單胞菌肺感染
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:21
    Clustering of Virtual Network Function Instances Oriented to Compatibility in 5G Network
    菌體蛋白水解液應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵的研究
    持續(xù)性根尖周炎中牙齦卟啉單胞菌的分離與鑒定
    黃芩苷對一株產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌體內(nèi)外抗菌作用的研究
    銅綠假單胞菌金屬酶及整合酶的檢測
    久久精品国产综合久久久 | 高清毛片免费看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 成人国产av品久久久| 精品第一国产精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 看免费av毛片| 色网站视频免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲精品国产av成人精品| 在线观看www视频免费| av福利片在线| 欧美丝袜亚洲另类| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲成人手机| 97超碰精品成人国产| 桃花免费在线播放| 秋霞伦理黄片| xxxhd国产人妻xxx| 边亲边吃奶的免费视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| www.色视频.com| 国产成人一区二区在线| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日本色播在线视频| 成人免费观看视频高清| videos熟女内射| 午夜福利影视在线免费观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲丝袜综合中文字幕| 免费看av在线观看网站| 午夜福利视频精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品熟女久久久久浪| 一级,二级,三级黄色视频| 丝袜在线中文字幕| 一区二区三区精品91| 久久久久久久大尺度免费视频| 美女主播在线视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久国产一区二区| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 国内精品宾馆在线| 男女无遮挡免费网站观看| 色5月婷婷丁香| 热re99久久国产66热| 天堂中文最新版在线下载| 成人二区视频| 亚洲国产av影院在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产av精品麻豆| 久热久热在线精品观看| 成人漫画全彩无遮挡| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩av免费高清视频| 久久国产精品大桥未久av| 国产精品一区www在线观看| 美女国产视频在线观看| 久久久欧美国产精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 女人久久www免费人成看片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 久热久热在线精品观看| 亚洲国产av新网站| 国产免费福利视频在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| av福利片在线| 超碰97精品在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 激情视频va一区二区三区| 在线天堂最新版资源| av一本久久久久| 捣出白浆h1v1| 亚洲伊人色综图| 天堂8中文在线网| 波多野结衣一区麻豆| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 美国免费a级毛片| 国产精品三级大全| 观看av在线不卡| 黑丝袜美女国产一区| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产亚洲一区二区精品| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲国产色片| 深夜精品福利| 成人午夜精彩视频在线观看| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品 国内视频| 久久久久久久久久久免费av| 深夜精品福利| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 男人舔女人的私密视频| 水蜜桃什么品种好| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产亚洲欧美精品永久| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美日韩综合久久久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 熟妇人妻不卡中文字幕| 水蜜桃什么品种好| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲成人av在线免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费看av在线观看网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产免费又黄又爽又色| 99久久人妻综合| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产一区亚洲一区在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲久久久国产精品| 国产成人精品一,二区| 久热久热在线精品观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 我要看黄色一级片免费的| 在线观看免费高清a一片| 精品第一国产精品| 高清av免费在线| 观看av在线不卡| 国产 一区精品| 最近中文字幕2019免费版| 国产在线免费精品| a级片在线免费高清观看视频| 日本欧美视频一区| videos熟女内射| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲综合精品二区| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品色激情综合| 日本与韩国留学比较| 成人毛片a级毛片在线播放| 伦理电影大哥的女人| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 2021少妇久久久久久久久久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 桃花免费在线播放| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久欧美国产精品| 亚洲国产成人一精品久久久| av不卡在线播放| 精品第一国产精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 91aial.com中文字幕在线观看| 日本黄大片高清| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 人人澡人人妻人| 七月丁香在线播放| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产在线视频一区二区| 美女视频免费永久观看网站| a级毛片黄视频| 国产精品一区www在线观看| 亚洲综合精品二区| 一级毛片我不卡| 亚洲综合精品二区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 男女国产视频网站| 少妇的逼好多水| 十分钟在线观看高清视频www| 22中文网久久字幕| 亚洲一码二码三码区别大吗| 九九在线视频观看精品| 欧美日韩综合久久久久久| 色94色欧美一区二区| 看免费成人av毛片| 国产午夜精品一二区理论片| 日韩一区二区视频免费看| 美女中出高潮动态图| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 欧美xxⅹ黑人| 欧美xxⅹ黑人| 国产精品成人在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产视频首页在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 少妇熟女欧美另类| 又黄又粗又硬又大视频| 又大又黄又爽视频免费| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲在久久综合| 高清av免费在线| 大码成人一级视频| 国产亚洲欧美精品永久| 国国产精品蜜臀av免费| av天堂久久9| 综合色丁香网| 九色成人免费人妻av| 日韩三级伦理在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 欧美另类一区| 男女国产视频网站| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 成人无遮挡网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久久久精品性色| 美女视频免费永久观看网站| 丁香六月天网| 少妇的逼水好多| 18禁国产床啪视频网站| 国产伦理片在线播放av一区| 十八禁网站网址无遮挡| 熟女av电影| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 视频区图区小说| 大陆偷拍与自拍| 国产色爽女视频免费观看| 免费大片18禁| 看非洲黑人一级黄片| 九九在线视频观看精品| 一个人免费看片子| 99九九在线精品视频| 大码成人一级视频| 国产极品天堂在线| 精品少妇黑人巨大在线播放| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 妹子高潮喷水视频| 黄片播放在线免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲性久久影院| 晚上一个人看的免费电影| 97精品久久久久久久久久精品| 国产精品蜜桃在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产又色又爽无遮挡免| 色网站视频免费| 蜜臀久久99精品久久宅男| 最新中文字幕久久久久| av免费在线看不卡| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲国产色片| 久久久久久人妻| 精品国产一区二区三区四区第35| 十八禁网站网址无遮挡| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲美女黄色视频免费看| 桃花免费在线播放| 国产精品女同一区二区软件| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 晚上一个人看的免费电影| 日韩电影二区| 国产一区二区激情短视频 | 啦啦啦视频在线资源免费观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美亚洲日本最大视频资源| 一级爰片在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 国产免费福利视频在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 在线观看三级黄色| 久久综合国产亚洲精品| 最后的刺客免费高清国语| 水蜜桃什么品种好| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 赤兔流量卡办理| 中国美白少妇内射xxxbb| videosex国产| 亚洲成人av在线免费| 丝袜人妻中文字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| 一级毛片电影观看| 成人漫画全彩无遮挡| xxxhd国产人妻xxx| 99久久精品国产国产毛片| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲精品一区蜜桃| 18禁国产床啪视频网站| 免费高清在线观看日韩| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲国产av新网站| 欧美少妇被猛烈插入视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产免费一区二区三区四区乱码| 在现免费观看毛片| 欧美精品av麻豆av| 久久久久久久精品精品| 免费日韩欧美在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| videos熟女内射| 两个人免费观看高清视频| av有码第一页| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 69精品国产乱码久久久| 国产精品人妻久久久影院| 伦理电影大哥的女人| tube8黄色片| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 日韩大片免费观看网站| 久久热在线av| 亚洲精品第二区| 国产xxxxx性猛交| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美xxⅹ黑人| av片东京热男人的天堂| 欧美日韩综合久久久久久| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 91精品国产国语对白视频| 另类精品久久| 日韩一区二区视频免费看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 人人妻人人澡人人看| 黄片播放在线免费| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产色爽女视频免费观看| 欧美日韩综合久久久久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久ye,这里只有精品| 国产精品久久久久久精品电影小说| 老熟女久久久| 成人免费观看视频高清| 五月伊人婷婷丁香| 日本爱情动作片www.在线观看| 少妇 在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品久久午夜乱码| 99热6这里只有精品| 男女午夜视频在线观看 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 人妻少妇偷人精品九色| 精品亚洲成a人片在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 国产永久视频网站| 九色成人免费人妻av| 日韩免费高清中文字幕av| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 日本黄色日本黄色录像| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一级片'在线观看视频| 欧美人与性动交α欧美软件 | 国产成人精品久久久久久| 黄片无遮挡物在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 99热这里只有是精品在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 国产成人精品无人区| 国产亚洲欧美精品永久| 99久国产av精品国产电影| 涩涩av久久男人的天堂| 夫妻性生交免费视频一级片| 日本午夜av视频| 日日爽夜夜爽网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产一区二区激情短视频 | 日韩免费高清中文字幕av| 毛片一级片免费看久久久久| 我要看黄色一级片免费的| 三上悠亚av全集在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久精品夜色国产| 国产乱人偷精品视频| 精品酒店卫生间| 亚洲av男天堂| 亚洲精品日本国产第一区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 插逼视频在线观看| av片东京热男人的天堂| 婷婷色综合www| 国产又爽黄色视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 日日撸夜夜添| 美女内射精品一级片tv| 18禁观看日本| 美国免费a级毛片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 777米奇影视久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲欧美色中文字幕在线| 黄色一级大片看看| 久久久久久久久久久久大奶| 国产视频首页在线观看| 久久精品夜色国产| 久久久欧美国产精品| 久久人妻熟女aⅴ| 大片电影免费在线观看免费| 在线 av 中文字幕| 日韩欧美一区视频在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 久久久久久伊人网av| av卡一久久| 九九爱精品视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| 久久久久久伊人网av| 亚洲av免费高清在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 成人毛片60女人毛片免费| 精品久久国产蜜桃| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美人与善性xxx| 亚洲美女黄色视频免费看| av在线播放精品| 久久人人97超碰香蕉20202| 精品国产露脸久久av麻豆| 九色成人免费人妻av| 国产日韩欧美视频二区| 久久鲁丝午夜福利片| 国产国语露脸激情在线看| 美女内射精品一级片tv| tube8黄色片| 制服丝袜香蕉在线| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 51国产日韩欧美| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 男男h啪啪无遮挡| 日日啪夜夜爽| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 麻豆乱淫一区二区| 国产一区二区三区综合在线观看 | 九色亚洲精品在线播放| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲美女黄色视频免费看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 97在线人人人人妻| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久久国产一区二区| 99热6这里只有精品| a级片在线免费高清观看视频| 国产一区二区三区av在线| 午夜福利视频精品| 亚洲少妇的诱惑av| 插逼视频在线观看| 在线观看三级黄色| 最近2019中文字幕mv第一页| 在线天堂中文资源库| 成人国产av品久久久| 观看av在线不卡| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 丝袜喷水一区| 成人毛片60女人毛片免费| 国产综合精华液| 香蕉精品网在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 如何舔出高潮| 国产免费福利视频在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 国产在线一区二区三区精| 美女大奶头黄色视频| 国产av精品麻豆| 一级,二级,三级黄色视频| 国精品久久久久久国模美| 国产又爽黄色视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲成人手机| 日韩视频在线欧美| 国产精品成人在线| 精品国产国语对白av| 国产精品国产av在线观看| 午夜日本视频在线| 欧美精品av麻豆av| 国产在线一区二区三区精| 日本免费在线观看一区| 国产成人免费观看mmmm| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产高清不卡午夜福利| 久久午夜综合久久蜜桃| 免费看av在线观看网站| 免费观看在线日韩| 色视频在线一区二区三区| 国产色爽女视频免费观看| 波多野结衣一区麻豆| 少妇熟女欧美另类| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲国产精品一区三区| 91成人精品电影| 男人操女人黄网站| 曰老女人黄片| 女人久久www免费人成看片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 69精品国产乱码久久久| 在线 av 中文字幕| 少妇高潮的动态图| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品日本国产第一区| 国产欧美亚洲国产| 夫妻午夜视频| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲精品视频女| 国产精品嫩草影院av在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 有码 亚洲区| 乱人伦中国视频| 午夜av观看不卡| 免费黄色在线免费观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品国产一区二区三区四区第35| 美女主播在线视频| 99热6这里只有精品| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 欧美性感艳星| 午夜影院在线不卡| 久久这里只有精品19| 亚洲成人一二三区av| freevideosex欧美| 国产精品熟女久久久久浪| 99国产综合亚洲精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 色5月婷婷丁香| 国产成人精品婷婷| 亚洲伊人色综图| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 黄色视频在线播放观看不卡| 99视频精品全部免费 在线| 国产av国产精品国产| 久久av网站| 91久久精品国产一区二区三区| 国产色婷婷99| 我的女老师完整版在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 日本午夜av视频| 国产乱来视频区| 午夜日本视频在线| 国产精品一区www在线观看| 国产av码专区亚洲av| 91精品国产国语对白视频| 成年人免费黄色播放视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 精品视频人人做人人爽| 亚洲综合色惰| 久久精品国产亚洲av天美| 久久精品国产自在天天线| 成人二区视频| 国产精品偷伦视频观看了| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 少妇精品久久久久久久| 伊人亚洲综合成人网| 久久久久久久精品精品| 亚洲少妇的诱惑av| 精品福利永久在线观看| 两个人看的免费小视频| 乱人伦中国视频| 一级,二级,三级黄色视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 丝瓜视频免费看黄片| 国产免费福利视频在线观看| 免费大片18禁| 国产日韩欧美亚洲二区| 日韩一本色道免费dvd| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 天天影视国产精品| 国产精品偷伦视频观看了| 9191精品国产免费久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 成人黄色视频免费在线看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产日韩欧美亚洲二区| 丝袜人妻中文字幕| 精品国产国语对白av| 精品一品国产午夜福利视频| 大香蕉久久成人网| 久久午夜福利片| 免费人成在线观看视频色| 最新的欧美精品一区二区| 搡老乐熟女国产| 国产日韩欧美视频二区| 宅男免费午夜| 中文欧美无线码| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产成人欧美| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 成人国产麻豆网| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美精品自产自拍| 综合色丁香网| 熟女av电影| 精品一区在线观看国产| 午夜福利乱码中文字幕| 九色成人免费人妻av| 男女无遮挡免费网站观看| 各种免费的搞黄视频| 丝袜喷水一区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 极品人妻少妇av视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 极品人妻少妇av视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成人国语在线视频| tube8黄色片| 国产成人精品婷婷| 成年女人在线观看亚洲视频|